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□ 张宏博 王洋 王燕 王岩 靳志敏 范鑫 郑玉山(通讯作者) 内蒙古自治区食品检验检测中心
摘 要：喹诺酮类药物是具有4-喹诺酮基本结构并且由人工合成的抗生素类药物，是一种人畜共用药，食用含有喹诺酮残留的食品会对人体造成危害。本实验参照GB/T 21312-2007，采用液相色谱-质谱/质谱法对羊肉中6种喹诺酮类药物的残留量进行检测。检测结果显示，环丙沙星、氧氟沙星、培氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星检出限分别为0.06μg/kg、0.02μg/kg、0.07μg/kg、0.05μg/kg、0.06μg/kg、0.05μg/kg;回收率为84.1%~102.1%，各物质的精密度依次是10.5%、7.4%、8.5%、6.8%、6.9%、7.2%;空白对照值为零;本次实验所采集的12种羊肉样品均未检出环丙沙星、氧氟沙星、培氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星这6种抗生素类药物，符合农业部标准。
关键词：液相色谱-质谱/质谱法 喹诺酮类药物 氧氟沙星 环丙沙星 诺氟沙星
1 引言
抗生素类兽药长期无节制的使用会导致动物免疫力下降，同时降低了疫苗的作用，进而使细菌疾病成为家禽的重点传染疾病[1]。喹诺酮是一类人畜通用药，因其具有组织浓度高、药物保留性好、抵抗多种细菌、杀菌作用强、抗菌时间长等特点而被广泛应用于水产和畜禽等疾病的治疗[7]。尽管喹诺酮药物有诸多优良品质，但仍需重视其毒副作用，如造成肝损害、引发周围神经病变时间加快，甚至可能产生不可逆的转变——导致肌无力症状的患者病情加重等[8]。
喹诺酮是羊肉检测中最为常见的一种兽药残留，其严重影响羊肉制品的安全及羊养殖业的发展，也已成为我国羊肉食品出口的主要制约因素。因此，检测羊肉中喹诺酮的残留对于食品安全管控有重大意义。
2 材料与方法
本实验参照GB/T 21312-2007农业部第235号公告，利用液相色谱-质谱/质谱法检测羊肉中培氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、洛美沙星、环丙沙星6种喹诺酮的残留量。
2.1 设备
实验设备如表1所示。
2.2 试剂
除特别标注外，此次实验中所使用的试剂全部都为色谱纯，水为GB/T 6682规定的一级水，实验试剂如表2所示。
2.3 喹诺酮类药物的检测方法
2.3.1 提取
称取5g试样(精确至0.01g)，装于50mL具螺旋盖聚四氟乙烯离心管中，之后加入10mL甲酸-乙腈(2∶98)溶液，立即盖盖剧烈振摇，旋涡震荡1分钟，超声提取10分钟，4000r/min离心5分钟，然后将乙腈层移入另一干净的聚四氟乙烯离心管中。向离心后的沉淀物中再加入10mL甲酸-乙腈(2∶98)溶液摇匀，旋涡震荡1分钟，4000r/min离心5分钟，合并乙腈提取液，待净化。
2.3.2 净化
向提取液中加入15mL乙腈饱和正己烷溶液，漩涡震荡2分钟，4000r/min离心5分钟，除去上层正己烷，氮吹至干。准确加入1mL初始比例流动相溶液，超声1分钟，旋涡震荡1分钟溶解残渣，将溶液过0.22μm微孔滤膜，供高效液相色谱-质谱/质谱测定。
2.3.3 高效液相色谱-质谱/质谱法测定
液相色谱条件：色谱柱固定相类型为C18、色谱柱型号为ZORBAX Eclipse Plus C18;规格：2.1×100mm×1.8μm;柱温：40℃;室温：22℃;流动相组成：A为0.05%甲酸/水、B为乙腈;流速：0.3mL/min;进样量：3μL。
最优质谱条件：离子源(电喷雾正离子源);检测方式：多反映监测;电喷雾电压：4000V;离子源温度：350℃，汇总得出结果如表4。
3. 结果与分析
3.1 喹诺酮类标准物质
在浓度为5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、80.0ng/mL、100.0ng/mL得到的线性方程，洛美沙星：Y=52.868650X+16.294115;恩诺沙星：Y=77.573131X+39.593310;诺氟沙星：Y=35.557671X-0.922820;环丙沙星：Y=26.118163X+19.661136;氧氟沙星：Y=89.435717X+17.011289;培氟沙星：Y=41.097360X+130.387546。相关系数R2均为0.99，峰面积与被测物质浓度呈现出的线性关系良好。
3.2 试剂空白
样品空白如表6所示，在3.021~3.201min之间没有出现峰，所以诺氟沙星未检出;在3.181~3.621min之间没有出现峰，所以氧氟沙星未检出;在2.901~3.341min之间没有出现峰，所以培氟沙星未检出;在3.141~3.321min之间没有出现峰，所以环丙沙星未检出;在2.651~2.521min之间没有出现峰，所以洛美沙星未检出;在3.161~3.602min之间没有出现峰，所以恩诺沙星未检出。
如表7所示，本次实验检测方法为，建立6个加入浓度为100ng/mL混合中间标准溶液50μL的空白试验与空白试剂对照，将检测到的各个噪音参数的结果记下来，当S/N=3时得到的最低浓度结果为检出限。
3.4 回收率
如表8所示，因为在实验过程中所有加入的物质都会有一定损失，故可能导致最终结果有所误差。为防止这一现象的发生，在羊肉中加入已知浓度的标准样液，经过涡旋震荡后按实验步骤作其检测值与羊肉样品检测值比较计算，从而知晓试剂是否有配对，羊肉样品的检测结果是否无误。
3.5 精密度
精密称取6个空白样品，加入1μg/mL的混合标准中间溶液40μL，按样品处理同法操作。经计算得出，氧氟沙星精密度为7.4%、诺氟沙星精密度为6.8%、恩诺沙星精密度为6.9%、环丙沙星精密度为10.5%、培氟沙星精密度为8.5%、洛美沙星精密度为7.2%。
3.6样品检测
本次试验共检测苏尼特羊、呼伦贝尔羊、大尾羊、山羊、绵羊、小尾寒羊、羊肝、羊毛肚、羊前腿、羊后腿、羊蹄筋、羊心12种羊肉样品，每种样品检测2个，以减小随机误差，提高检验的准确性。
根据农业部标准的要求，氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星和洛美沙星均不得检出，环丙沙星和恩诺沙星之和小于等于100μg/kg才为合格品，反之则为喹诺酮类药物残留，不合格。
检测结果如表10所示，12种羊肉样品中均未检测出6种喹诺酮药物，所取羊肉样品均符合农业部标准，为合格品，消费者可放心购买。
4 结论
本实验确定了环丙沙星、氧氟沙星、培氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星试剂空白值全部为0，检出限分别为0.06μg/kg、0.02μg/kg、0.07μg/kg、0.05μg/kg、0.06μg/kg、0.05μg/kg，回收率为84.1%~102.1%，各物质的精密度依次是10.5%、7.4%、8.5%、6.8%、6.9%、7.2%。实验中所用苏尼特羊、呼伦贝尔羊、大尾羊、山羊、绵羊、小尾寒羊、羊肝、羊毛肚、羊前腿、羊后腿、羊蹄筋、羊心12种羊肉样品均未检出6种喹诺酮类药物，本次实验所采羊肉样品符合农业部标准，均为合格品。
参考文献：
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[2] 马建民，夏曦，李晓薇.阴离子交换固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法检测猪肌肉中13种喹诺酮类药物[J].中国食品卫生杂志，2015，25(3):249-253.
[3] Thomas H. Tracking persistent pharmaceutical residues from municipal sewage to drinking water[J]. Journal of Hydronautics. 2002.
[4] 胡梁及，朱盛山，彭亮等.水产养殖中药物滥用的危害及问题分析[J].水产学杂志.2015(02).
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[10] 杨卫军，李曼，曹秀梅等.超高效液相色谱法检测鸡肉中氟喹诺酮类药物残留[J].现代畜牧兽医.2016(04).
基金项目：内蒙古自治区科技重大专项(2016年度);内蒙古自治区科技引领项目(2017年度、2018年度)。
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