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摘要：目前对病死鸡肉的检验检疫主要依赖于感官性状和病理变化的肉眼判断，有一定的主观性，亟需现场快速鉴定病死鸡肉的技术，以有效支撑基层动物卫生监督执法。本研究针对具有现场快速鉴定潜质的过氧化物酶法，验证了室温、冷藏和冷冻3种温度下，存放不同时间健康鸡肉（120份）和病死鸡肉（60份）样品中过氧化物酶的活性。结果显示：发生积血的病死鸡肉比正常屠宰的健康鸡肉显色更明显，病死鸡肉室温和冷藏状态下，不同时间节点显色时间多集中在4~8s，而健康鸡肉显色时间多超过35s或不显色；冷冻条件下，过氧化物酶会发生失活，但病死鸡肉过氧化物酶显色时间总体还是在30s以内，且3种温度下，存放不同时间的健康鸡肉与病死鸡肉样品的显色时间差异显著（P＜0.01）。以显色时间等于或低于30s作为判定病死鸡肉阳性的时间节点，发现过氧化物酶法对室温和冷藏状态鸡肉鉴定的敏感性均高于95%，特异性也在95%左右，对冷冻状态鸡肉的有效鉴定率也高于80%。可见过氧化物酶法可以用于不同温度、不同存放时间的病死鸡肉样品的现场快速有效鉴定。
我国是鸡肉生产和消费大国，而检疫工作是把好鸡肉食用安全的关口。受利益驱动，私屠滥宰病死或死因不明肉鸡的现象仍时有发生。而目前尚未建立快速有效鉴定病死或死因不明肉鸡及其产品的方法和技术规范，这为基层动物卫生的有效监督执法带来挑战。
过氧化物酶法是目前采用较为广泛的一种鉴定病死畜禽肉的理化方法。过氧化物酶法基本原理是肉浸液中的过氧化物酶催化过氧化氢产生氧气，进而氧化联苯胺生成绿色的二酰亚胺代对苯醌，使健康或新鲜肉迅速显蓝绿色，而病死或腐败肉不显色。前期，本课题组也研究了4种鉴定病死畜禽产品理化方法的有效性和适用性，发现过氧化物酶法在健康鸡肉中并不快速显色，这与李金梅等的发现一致，但同时发现此法在病死或死因不明发生积血的鸡肉中反而快速变蓝。这促使本研究进一步扩大样本量和时间点，对过氧化物酶法鉴定病死或死因不明鸡肉进行了更详细的研究，以期对病死肉鸡及其产品的快速检测提供参考。
材料与方法
样品收集
试验中60份病死鸡肉来源于山东省某肉鸡养殖场当天死亡的鸡只，120份健康鸡肉来自于山东省某肉鸡屠宰场屠宰线上的鸡只。健康鸡肉样品采集时，剖开表皮采集鸡胸肉；病死鸡肉样品采集时，同样剖开表皮，但特别注意采集积血一侧的鸡胸肉。样品采集后，均独立放于无菌塑封袋中，低温下当天送实验室，分别于室温、4℃冷藏和-20℃冷冻保存。
检测时间
对不同温度保存的健康和病死鸡肉样本，分别按表1中的时间存放后取出检测。
样品检测
自采样肉品切取片状肌肉（3cm×2cm×0.5cm）一块，新鲜切面朝上平置于培养皿中。健康鸡肉本色呈白色，而病死积血鸡肉本色为红色。在肉片上滴加0.2%联苯胺乙醇溶液5滴、1%过氧化氢溶液2滴，分别记录变蓝的时间（即显色时间）。
统计学分析
通过t检验，分析3种温度下存放不同时间的健康鸡肉与病死鸡肉样品的显色时间是否有显著差异。
结果
鸡肉显色
从采集的健康鸡肉和病死鸡肉的大体照（图1-A）看，健康鸡肉呈粉白色，而病死鸡肉出现明显一侧性血液沉积，局部呈红色。分别从健康鸡肉随机割取，从病死鸡肉红色部位割取片状肉块，进行过氧化物酶显色反应。结果（图1-B）显示：病死鸡肉表面和边缘几秒内迅速出现蓝绿色，而健康鸡肉约1min后沿肉边缘出现蓝色，肉表面仅有星星点点的不明显的蓝色。
显色时间
肉质在不同温度下，经过不同时间的变化也不同，室温（22~25℃）存放3d即开始腐败，4℃冷藏7d后开始有腐败现象发生，而-20℃冷冻60d后依然肉质较正常。利用过氧化物酶法，对不同温度下、贮存不同时间的40份健康鸡肉和20份病死鸡肉进行检测，用中位数（95%置信区间上、下限）表示显色时间。结果显示（表2及图2）：健康鸡肉采样当天和室温存放1d、2d的健康鸡肉中95%都超过了35s，2d后不再出现显色样品，3d时只有4个显色样品，4d时全部出现显色反应；而室温条件下、不同存放时间的病死鸡肉样品显色时间均集中在5.0~8.0s。室温下存放0~5d的健康鸡肉与病死鸡肉样品的显色时间差异显著（P＜0.01）。
冷藏存放不同时间点的健康鸡肉中，95%样品的过氧化物酶反应显色时间超过35s，从存放7d开始出现不显色样品，到15d时不显色样品达82.5%（33/40）；而病死鸡肉样品，不同时间点的显色时间主要集中在4.0~8.0s（表3、图3）。冷藏条件下，存放1~15d的健康鸡肉与病死鸡肉样品显色时间差异显著（P＜0.01）。
冷冻存放不同时间点的过氧化物酶法检测显色时间如图4及表4所示：95%的健康鸡肉样品的显色时间均超过35s，存放5d时出现7个不显色样品，但随着时间延长，不显色样品数量增加并不明显，60d时不显色样品为10个。而病死鸡肉样品在冷冻条件下存放不同时间的显色时间相比室温和冷藏状态有所延长，多集中在15~22.5s，直到10d时才出现1例不显色样品。过氧化物酶法对冷冻状态鸡肉检测，整体上显色时间是推迟的，说明冷冻条件下，鸡肉内的过氧化物酶多发生失活现象，但仍保留部分活性。冷冻条件下，存放5~60d的健康鸡肉与病死鸡肉样品显色时间差异显著（P＜0.01）。
有效性评价
通过比对过氧化物酶法检测健康鸡肉和病死鸡肉的显色时间差异，初步确定30s为鉴定健康鸡肉和病死鸡肉的界限。即显色时间小于或等于30s为病死鸡肉（阳性），大于30s或者不显色为健康鸡肉（阴性）。另外，上述试验发现，存放温度对过氧化物酶法检测结果的影响较大。因此，接下来根据30s的显色判定时间，对不同存放温度下过氧化物酶法鉴定病死鸡肉的有效性进行了评价。结果显示（表5及图5）：过氧化物酶法对室温和冷藏状态鸡肉的鉴定非常有效，准确度均高于95%，敏感性均大于95%，特异性也在95%左右；对冷冻状态鸡肉的有效鉴定率也高于80%，但是敏感性略低，特异性尚可。
讨论
已报道的检测病死畜禽肉的理化方法有多种，如pH法、过氧化物酶法、硫酸铜沉淀法、微生物毒素法等，特别是过氧化物酶法，由于其具备现场快速检测的优势，备受研究者青睐。近些年推出了数种基于过氧化物酶法的快速检测技术，但均是针对病死或不新鲜的猪肉，而针对病死鸡肉的深入研究并不多。本实验室前期研究了上述4种理化方法鉴定病死畜禽产品的有效性，发现硫酸铜沉淀法可以较有效鉴定病死鸡肉，微生物毒素法由于样品采集时很难避免环境微生物等的暴露，检测结果在健康鸡肉和病死鸡肉间没有显著差异，pH试纸法也没有显著差异。与常规思维不同，本研究发现一些病死鸡肉样品（积血浸润肉）过氧化物酶法的显色时间反而早于健康鸡肉，这似乎与健康肉品中过氧化物酶含量更丰富相悖。
过氧化物酶是一种广泛存在于动植物等真核生物中的一类氧化酶，催化由过氧化氢参与的氧化反应。血红蛋白和肌红蛋白是血液和肌肉中运输氧气的主要大分子，两者在结构上与辣根过氧化物酶非常类似。已有研究表明，血红蛋白和肌红蛋白确实有过氧化物酶活性。正常屠宰的健康鸡肉经过放血环节，鸡肉中没有血液浸润，血红蛋白含量相对不高，而病死鸡肉在鸡发病至死亡过程中往往发生一侧性积血，而且积血多出现在靠下的胸腹部，所以采集的病死鸡胸肉样品中基本都有积血浸润现象，即这些病死鸡肉样品中的血红蛋白比健康鸡肉多，因此理论上过氧化物酶法显色更快、更明显。
本研究扩大了样本量，进一步检测了室温、冷藏和冷冻3种不同温度下、不同存放时间的健康鸡肉和病死鸡肉中过氧化物酶的活性，结果发现，积血的病死鸡肉中过氧化物酶活性确实较高，不同温度、不用存放时间的过氧化物酶显色时间普遍较健康鸡肉短，且两者有显著差异（P＜0.01）。于是选择30s的显色时间作为过氧化物酶法判定健康鸡肉和病死鸡肉的时间节点，显色时间≤30s即为病死鸡肉阳性。随后，对此鉴定方法的特异性和敏感性进行了评价，发现对室温和冷藏状态鸡肉的有效鉴定率均高于95%，冷冻状态鸡肉的有效鉴定率也在80%以上。可见，过氧化物酶法鉴定病死鸡肉，快速、敏感、特异，而且不需要特殊仪器设备，可以作为一种现场快速鉴定病死鸡肉的有效方法。
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