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动物源性食品中霉菌毒素的检测——黄曲霉毒素
现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2021/7/19 11:59:22 关注：946 评论： 我要投稿
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黄曲霉毒素（aflatoxin，AF）是真菌毒素的重要代表之一，是由常见霉菌黄曲霉、寄生曲霉和集峰曲霉产生的一种结构类似物。黄曲霉在自然界中的存在较寄生曲霉普遍，该菌能在受侵染的粮食和油料作物（尤其是玉米和花生）上生长、繁殖、产生黄曲霉毒素。AF对肝脏有剧毒，能致畸、致癌和致突变（简称“三致”），已经被发现的AF衍生物有20多种，其中AFB1毒性最大，也最具有代表性。文献资料和多年监测积累的数据都证实，动物源性食品中AF多呈单品种检出，在动物组织中多以AFB1的形式、在奶和奶粉中以AFM1的形式检出。本部分综述了AF的理化性质、毒理学与危害、国内外限量要求以及残留检测的样品前处理、仪器测定方法等内容，以期为该类污染物的全面了解和残留检测提供参考。
1 理化性质
各类AF的基本结构都具有二呋喃环和香豆素（图4-1），相对分子质量为312～346。难溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚。一般在中性及酸性溶液中较稳定，在强酸性溶液中稍有分解，在pH9～10的强碱溶液中分解迅速。其纯品为无色结晶，耐高温，AFB1的分解温度为268℃，紫外线对低浓度AF有一定的破坏性。
AFM1是AFB1的羟基化代谢产物，主要存在于牛奶中。AFM1也可由一些黄曲霉和寄生曲霉直接产生，但与其他毒素（如AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）相比比例相当低。AFM1有致癌性，其外观为白色或微黄色的粉末，分子式为C17H12O7，相对分子质量为328。此外还有AFG1、AFG2等衍生物类型。各类AF的理化性质见表4-1。
2 毒理学与危害
AF对包括家禽和家畜在内的若干动物具有强烈的毒性，其毒性作用主要是对肝脏的损害。因为AFB1在AF的衍生物中占主要成分，而且AFB1的毒性最大，因此一般以AFB1作为动物毒性试验。动物因种类、性别、年龄、营养状况不同对AFB1的敏感性有很大差异，最敏感的动物是雏鸭。
动物急性中毒时主要表现为食欲下降、体重减轻，死后解剖肉眼可见肝脏出血、坏死，病理变化主要表现为肝实质细胞变性、坏死、纤维化及胆管上皮细胞增生，其他脏器如脾、肾、睾丸等也会引起退行性病变。
AF除了具有急性毒性外，还有强烈的致癌性，主要引发肝癌。AF是目前已知的最强的致癌物。大量研究表明，对于大鼠、小鼠、豚鼠、雏鸭、犬、猫、兔等动物，长期低剂量或短期较大剂量地摄入AF可诱发原发性肝癌，其中以大鼠最为敏感。
肝脏是AFB1的主要目标器官，然而通过消化系统和呼吸系统摄入AFB1也可能会导致肝癌。AFB1的生物转化主要是细胞色素P450介导的，细胞色素P450主要存在于肝细胞内，这可能是AFB1易诱发肝癌的重要原因；而在某些试验中，前列腺素H和脂肪氧合酶对AFB1的激活作用可能比细胞色素P450更为重要。
AF在自然界中普遍存在，很容易污染食品，而且能在粮食及油料等食物上生长、繁殖、产生毒素。食品用动物吃了被AF污染的饲料后，AF会在体内代谢生成AFM1，直接威胁人类的食品安全与健康。通常哺乳动物摄入被AFB1污染的饲料和食品后，一部分AFB1蓄积于动物组织及其产品中，如肝、肾、血液、肌肉和蛋中，另一部分AFB1则转化为AFM1而存在于动物分泌的乳汁和产生的尿液中，转化率为3.45%～11.39%。因此动物源性食品中危害人类健康的AF主要是AFB1与AFM1。
3 国内外限量要求
AF危害性大、分布范围广，为了预防AF中毒，已有70多个国家和地区对食品中AF的含量做了限量要求，CAC推荐食品、饲料中AF最大允许量标准为总量（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的总和）小于15μg/kg；牛奶中AFM1的最大允许量为0.5μg/kg。1999年欧盟规定食品中的AF总量不得超过4μg/kg，AFB1不得超过2μg/kg。我国对食品中AFB1的限制标准（GB2761—2017）是：花生、玉米、花生油及其制品的AFB1≤20μg/kg；大米及其他食用油的AFB1≤10μg/kg；粮食、豆类、发酵食品的AFB1≤5μg/kg；婴儿代乳品不得检出。CAC规定鲜牛奶中AFGM1的限量为0.5μg/L。
4 样品前处理方法
4.1 提取
检测乳及乳制品中的AFM1时，因为其成分复杂，且AFM1在乳及乳制品中仅为痕量，为了减少干扰和误差，必须在定量测定前先对试样进行提取、净化等前处理。Martin等选择了6种提取和净化方法进行比较，结果明确地显示，采用Sep-Pak柱提取和净化牛奶中AFM1的方法在节约操作时间、提高最终提取物的净化程度方面均有极大的优越性。若试样中含有大量的蛋白质，可用Zn（OH）2或Pb（AC）2脱去蛋白质或用丙酮处理以沉淀蛋白质；若试样中含有较多的脂肪，可用正己烷萃取或冷冻离心除去，或在Na2SO4-Al2O3-Na2SO4色谱柱上，用甲苯和三氯甲烷洗脱除去。对于饲料和食用油等，一般使用乙腈除去其中的蛋白质，用正己烷脱脂。
4.2 净化
提取样品中的AF后，还需要一定的前处理方法将提取物中干扰检测的化合物除去，对AF进行富集。最初采用的前处理方法是液-液萃取技术，通过AF在不同极性溶剂中溶解度的差异进行富集。目前多采用固相萃取（SPE）技术，SPE柱中通用的固定相有硅胶、C18键合相、弗罗里硅土以及交联有抗体的免疫亲和色谱（IAC）柱。IAC柱对AF抗原产生特异性吸附作用，而且这种吸附可以被极性有机溶剂洗脱。Sobolev等报道了另一种净化方法，AF经甲醇:水（80:20）提取后，经过氧化铝小柱的单一清洗步骤可被液相色谱仪、荧光检测仪定量测定，此氧化铝小柱对AFB1的检出限为1μg/kg，从花生中得到的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2在5.0μg/kg、2.5μg/kg、7.5μg/kg、2.5μg/kg水平上回收率分别为（87.2±2.3）%、（82.0±0.8）%、（80.0±1.8）%和（80.2±2.8）%。
5 检测方法
5.1 高效液相色谱法（HPLC）
HPLC是近十几年发展起来的检测AF的方法，主要是用荧光检测器检测，在适宜的流动相条件下，采用反相C18柱，使多种AF同时分离。其原理是将样品中的AF经柱层分离后，通过测量色谱峰的面积计算含其量。其优点是特异性强、灵敏度高、定量准确，可同时分离多种AF，操作简便，定量精确，适于大批量样品的分析。AFB1和AFM1荧光强度较强，但在含水的溶剂中容易发生淬灭，因此一般对AF进行柱前或柱后衍生化以提高待测物的检测灵敏度。
Dunne等采用免疫亲和色谱柱进行前处理，通过溴化吡啶行柱后衍生，用HPLC-荧光检测器进行定量检测。Stroka等为了评价IAC净化-HPLC柱后溴衍生荧光检测法在检测欧盟限量以下AF的有效性，在空白基质中分别添加了2个含量水平的AF：2.4ng/mL总AF（1.0ng/mL的AFB1）和9.6ng/mL总AF（4.0ng/mL的AFB1），AF总量的回收率是71%～92%，其中AFB1的回收率是82%～109%。
美国、加拿大等国实验室则验证了反相HPLC柱后碘衍生化（PCD）检测各个AF含量的方法。9个实验室采用PCD方法，在回收率试验中添加3个含量水平的AF：10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL AF总量。方法的回收率分别为：81%、81%、83%，组内相对标准偏差（RSD）为5.02%～17.22%，组间RSD为4.21%～57.28%。
李佐卿等将免疫亲和色谱柱与三氟乙酸柱前衍生化联用，对蜂蜜和酒中的AF测定建立了方法学，在样品中添加2.5μg/kgAF进行10次测定，平均回收率分别为AFG173.1%、AFB191.6%、AFG290.2%、AFB276.6%；样品10次测定的精密度试验的RSD分别为：AFG111.84%、AFB14.28%、AFG213.41%、AFB214.20%；实际最低检出限为6.25pg/kg。对比柱前和柱后衍生的灵敏度，柱前衍生要比柱后衍生的灵敏度高3倍左右。陈玉波等采用三氟乙酸柱前衍生，利用高效液相色谱同时测定食品中的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2（图4-2）。在样品加标回收试验中，样品中AF的添加浓度分别为：AFB1、AFG1 40μg/kg，AFB2、AFG2 10μg/kg，AFM1、AFM2 200μg/kg；结果回收率在78%～102%（图4-3），测定5次的RSD为：AFM1 2.25%、AFG1 3.27%、AFB1 2.93%、AFG2 2.35%、AFB2 2.73%、AFM2 2.77%。结果表明此方法有效，可以将6种AF进行很好的分离，并且对食品中的6种AF能够很好地定量。
柱后光化学衍生化可使样品液缓慢流经光化学衍生器中，被紫外灯管照射的时间延长，AFB1和AFG1的荧光强度大大提高。史莹华等采用免疫亲和色谱柱纯化，反相HPLC分离，柱后光化学衍生，荧光检测器测定了动物肝脏和肌肉中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的含量；结果表明4种毒素可在10min内完成分离，线性范围为15～1500pg，线性回归系数大于0.9998；用本方法对动物肝脏和肌肉样品进行了加标回收试验，4种AF的平均回收率为68.7%～83.42%，相对标准偏差（RSD）为3.51%～7.40%，检出限达到265pg/kg。
张春艳等则建立了一种测定饲料及饲料原料中AF的光化学衍生-HPLC方法（图4-4）。试样经甲醇与水的混合液（80:20，V/V）提取，免疫亲和色谱柱净化、浓缩，高效液相色谱分离，在线柱后光化学衍生，荧光检测器检测，外标法定量，在优化的条件下，混合标准工作液中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的浓度分别为0.38～20.00μg/L时，浓度与峰面积线性关系良好，相关系数为0.9996～0.9999；在加标浓度为0.75～20.00μg/kg时，样品平均回收率为81.9%～98.7%，AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的检出限分别为0.05μg/kg、0.02μg/kg、0.05μg/kg、0.08μg/kg。
林海丹等报道了一种正相HPLC方法，采用免疫亲和色谱柱纯化，以无水甲醇-无水甲酸-二氯甲烷-正己烷-醋酸乙酯（10:10:200:240:40，V/V）为流动相，不需衍生化，硅胶HPLC柱荧光检测果仁中4种AF，最低检测含量0.1μg/g。
5.2 薄层色谱法（TLC）
虽然薄层色谱法灵敏度相对较差，但提取净化的不断改进和多种展开系统及显色剂的使用使该法具有较好的分离和专一性。其原理是样品经过提取、柱层析、洗脱、浓缩、薄层板展开分离后，在365nm紫外灯下，AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分别显示紫色、蓝紫色、绿色和绿色荧光。Thean等通过改变流动相成分或在不同波段下测AF。Simonella采用乙酸-乙腈-异丙醇-水（1:5:5:39，V/V）为流动相，荧光检测器激发波长352nm，发射波长442nm，可分离测定AFB1、AFB2、AFG1、AFG2。Sobolev等则研发了一种氧化物质（氧化铝）作为新流动相，可对农产品的甲醇-水提取液进行净化处理，样品中加标准品2.5～7.5ng/g，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的回收率为80%～87%，最低检出限为1.0ng/g。
国内外有大量关于建立薄层色谱法测定AFM1的报道。Schuller等建立的方法检出限为0.05μg/kg，回收率为98%；Tuinstra和Bronsgeest将其检出限提高到0.04μg/kg。Stubbfield建立的方法尽管未能达到上述水平，其检出限为0.1μg/kg，回收率仅为80%，但方法简便快速。Lucas等在提取系统中增加了碳酸氢钠，低温离心脱脂肪和蛋白质，最后用三氯甲烷提取AFM1，其回收率达到95%以上，在不使用柱层析净化的条件下，检出限可达到0.1μg/kg，如引入柱层析，则检出限可达到0.02μg/kg。
5.3 液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）
液相色谱-串联质谱法是近年来发展起来的一种仪器检测方法，是一种集高效分离和多组分定性定量分析于一体的系统，它将色谱的高效分离能力和质谱的高灵敏度这两种优势结合在一起，成为对很多种类化合物定性定量分析的有力工具。
张浩等采用了液相色谱-质谱联用技术检测花生中的AF，用80%甲醇溶液提取花生中的AF，经免疫小柱净化，以甲醇-乙酸水为流动相，在C18柱上对AFB1、AFB2、AFG1、AFG2进行分离，采用质谱正离子模式对AF进行检测。结果显示花生中的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的检测限分别为0.15μg/kg、0.09μg/kg、0.25μg/kg、0.5μg/kg，回收率为78%～110%，RSD为5.0%～10.3%。
林建忠等使用了液相色谱-离子阱质谱技术检测粮油食品中的AFB1。样品用80%甲醇溶液提取，经自制的净化柱，以甲醇-水为流动相，在C18柱上对样品中的AFB1进行分离，采用质谱正离子模式对AFB1进行检测。方法的线性范围为0.139～1.39μg/L，线性相关系数为0.9998；信噪比（S/N）＝3时，检出限为0.510g/kg。
郑燕等采用了先进的快速液相色谱串联三重四级杆质谱系统，运用二级质谱对花生样品中的4种AFB1、AFB2、AFG1、AFG2进行定性定量分析。样品粉碎后用体积比为84:16的乙腈-水混合液提取，过滤后通过真菌毒素净化柱进样，采用C18柱分离，0.1%甲酸溶液和甲醇做流动相，以60:40比例等度洗脱，质谱在多反应监测（MRM）的正离子模式（图4-5）下进行分析。4种组分在5min内完全分离，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的检出限分别是0.012μg/kg、0.009μg/kg、0.013μg/kg、0.007μg/kg，平均加标回收率为80%～95%（表4-2），相对标准偏差小于5%。
Friedli建立了质谱法测定AF，其中AFM1的检出限为100pg，并提出对试样进行简单的净化，如蒸干后再溶于甲醇-水（1:2）溶液中，可去除其他污染物的干扰。William等建立了两种质谱法分析农产品和生物体液中的AF，一是经薄层色谱法等净化过程的电子电离（electron ionization，EI）质谱分析，检出限为10～50ng/kg；二是高分辨选择离子监测（high resolution selected ion monitoring，HRSIM），可直接进行混合组分的分析，且较EI法灵敏度提高100倍以上。
朱聪英等则直接应用LC-MS法测定了饲料中6种AF（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2）的含量。试样中的AF经84%乙腈溶液超声提取后，用正己烷脱脂，过霉菌毒素多功能固相萃取柱净化，氮气吹至干，用流动相溶解后进行LC-MS/MS测定。方法的最低检出限为0.2μg/kg，定量限均为0.5μg/kg；标准工作液在0.5～100μg/L的范围内线性良好；加标浓度在1.0～100μg/kg，饲料中AF的回收率在66.1%～108%，批内RSD为17.8%，能满足相关法规要求。
5.4 免疫分析法
免疫化学法是根据免疫学抗原抗体高特异性结合原理，设计并发展起来的免疫学检测技术。该方法具有重现性好、灵敏度高、选择性强、特异性强、时间短、检测限低等特点，同时又能减少有害试剂的使用，对检测人员的健康起一定保护作用，在AF检测方面取得了很大的应用。具有代表性的主要有免疫层析法（ICA）、放射免疫法（RIA）、ELISA、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）等，它们均可以进行定量测定。其中由于放射免疫法需要特殊设备和安全保护，其应用受到了极大限制；免疫层析柱、胶体金试纸条及ELISA检测试剂盒是目前应用较为广泛的AF快速检测产品；TRFIA在AF检测方面尚属新技术，但TRFIA检测的高灵敏性使其在该领域的发展具备很大的潜力。
AF均属于小分子半抗原，需要与大分子载体蛋白偶联才能作为免疫原或检测抗原诱导AF特异性抗体的产生。目前AFB1人工抗原的制备方法为碳二亚胺法，该方法分为两种，一种是在有机相中进行反应的二环己基碳二亚胺法（DCC），另一种是在水相中进行反应的对乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺法（EDC）。DCC法需要在严格的无水条件下反应，所用的有机溶剂需预先脱水处理，且需要干燥的反应环境，较为繁琐；而EDC法可直接在水相中反应，操作简便。
EDC法制备AFB1人工抗原主要分为AFB1肟化物的制备和AFB1肟与BSA偶联两步反应（图4-6）。
ELISA是免疫分析法中最为常见的。ELISA检测AF的方法大体分为两类：一是用双抗体夹心ELISA法。将AFB1牛血清白蛋白涂于微滴定板池上，经初步培养后，加AFB1抗体和游离AFB1，用磷酸-4-硝基苯酯做基质，以碱性磷酸酶-抗兔免疫球蛋白检测第一抗体的结合；二是用竞争法检测样品中的AF。在涂抗体的小孔中，用乙烷萃取AFB1，并与结合了辣根过氧化酶的AFB1混合置室温下10min后，用水洗除未结合的AF共轭物，加底物后在405nm检测。
ELISA灵敏度高，比薄层色谱法的灵敏度可提高近200～500倍，特异性强，荧光物质、色素、结构类似物对结果无干扰，而且回收率高、准确性好、提取方法简单，测定时间只需2h左右，可同时检测近百份样品，大大提高了检测效率。我国在20世纪90年代中期开始开展了用ELISA检测AFB1的应用研究，取得了很好的效果，显示出该方法简便易行、耗时少、特异性强、灵敏度高的特点，对于大量样品的筛选检测尤为适合。
路戈等用单克隆抗体ELISA与薄层色谱法（TLC）对比检测了粮油样品，TLC检测结果表明，在方法灵敏度下（5ng/g）所检样本中均无AFB1检出。而这些样品按ELISA检测，AFB1检出率为96%，含量在0.05～2.20ng/g。ELISA的检测灵敏度远高于TLC法。一般认为AFB1间接竞争抑制ELISA（IDC-ELISA）定量分析法比传统TLC更具有简便、经济的特点，它不仅适用于大批量样品的快速检测，而且具有投入商品化生产及“家用化验”发展的潜力。
刘冬儿用ELISA测定食品中的AFB1，线性范围0.25～5.0ng/mL，检测灵敏度达0.015μg/kg，比TLC提高300～400倍，回收率大于89.2%，精密度大于7.67%。整个测定过程为4h，在很大程度上缩短了检测时间。
另外，ELISA检测AFB1的技术在肝癌病因与预防中也有较广泛的应用。迄今为止，人类食物中AF的普遍污染是人肝癌发生的可能因素的观点已得到了广泛承认。目前认为测定AF白蛋白（AF-Alb）化合物可以作为摄入AF的体内指标，并经全球众多的研究证实AF-Alb是一个用于估计AF暴露水平很好的标记。AF暴露的生物标记是基于对人类中这些化合物的了解而建立起来的。生物标记水平的改变可用来评价干预的有效性。Kensler、Wang等在多个地区进行了多项关于肝癌化学预防的试验，都借助了免疫吸附柱纯化等AF检测技术，并应用于受试者尿样或血样的分析，以评价预防干预的效果。
免疫亲和色谱（IAC）是美国分析化学家协会（AOAC）检测AF的标准方法。其原理是以单克隆免疫亲和色谱柱为分离手段，将单克隆抗体与载体蛋白成功偶联，偶联物填柱形成IAC柱，并与AF半抗原产生对应的特异性吸附关系。当样品通过柱子时，因抗原只能吸附相应的抗体，所以IAC也就只能吸附AF，别的杂质因不被吸附而流出柱子。IAC的优点是在检测过程中，检测人员不用直接接触AF，并接触很少试剂就完成整个检测，操作简单、耗时短、灵敏度高且能直接读数，所以应用范围很广。局限性是不能单独测AFB1、AFB2、AFG1和AFG2，只能测AF总量，同时对试剂要求也较高，如检测过程中所有用到的水必须是双蒸水，而所用的容器也必须用双蒸水洗涤。
胶体金免疫层析法（GICA）利用纳米金作为标记物，在很短的时间内就能测出待测物的含量，并可以直接读取结果。该技术不需要分离纯化样品，也无须对检测溶剂做任何的处理，真正做到一步检测，方便、高效。Zhang等通过此方法分析样品，用时不到10min，非常高效。在金标免疫试纸法的应用过程中，孙秀兰等研究了样品基质对试纸条信号灵敏度的影响，并为消除这些影响提供了经验。在检测样品中，对粗提取液用氯仿法萃取后，使其挥干再溶解，可将盐离子和重金属离子对测定的影响控制在允许范围之内；用石油醚脱脂，可将油脂对测定结果的影响降到最低。邓省亮等用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记抗AFB1单克隆抗体并喷于玻璃纤维上，AFB1偶联抗原和二抗分别结合于NC膜上，依次将样品垫、胶金垫、NC膜和吸水纸组装切割成胶体金试纸条并装入检测卡中。测试结果表明，AFB1快速检测试纸条的灵敏度为5ng/mL，检测时间为10min，批内和批间重复性为100%，假阳性率和假阴性率均为0。
时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）是超微量检测中一项新兴的检测技术，灵敏度可达10－19，较放射免疫法（RIA）高出3个数量级。原理与ELISA一致，不同的是TRFIA采用了一种特殊的标记物，即三价稀土离子（铕离子、铽离子等）代替酶标记物或其他荧光物，用时间分辨荧光仪测定产物中荧光强度，从而判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。TRFIA利用了稀土元素荧光波长与其激发波长的巨大差异，克服了普通紫外-可见分光光度分析法中杂色光的影响，可以大幅度提高分析的灵敏度。黄飚等采用自制AFB1全抗原和多克隆抗体，构建了一套较为完整的AFB1-TRFIA检测平台，具有较好的分析稳定性，灵敏度达到0.0039μg/L，线性范围0.0039～100μg/L，在灵敏度和测量范围方面均超越了市场上常用的进口或国产酶联免疫检测试剂（分别为0.1g/L和0.1～10μg/L），并经过多方面考核，各项指标符合标记免疫试剂的要求，对食品、饲料等样品检测效果均佳，具有很好的应用前景。
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| 文章作者：曲志娜 赵思俊等 中国兽医发布 文章编辑：一米优讯 |
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