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动物源性食品中兽药残留的检测——多肽类药物残留
现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2021/7/30 10:52:07 关注：714 评论： 我要投稿
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多肽类药物（polypeptides）是从多黏杆菌或产气孢子杆菌的培养液中提取制得的具有多肽结构特征的一类抗生素，包括多黏菌素、杆菌肽和维吉尼亚霉素等，可分别对抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、绿脓杆菌、真菌、病毒、螺旋体、原虫的感染，对败血症、呼吸道感染、泌尿道感染、牛乳腺炎等疾病有较好的治疗作用，被广泛用作家禽、猪、牛等的饲料添加剂和兽药，用来促进动物的生长和治疗畜禽疾病。多肽类药物的最大优点是细菌不易产生耐药性，但缺点为毒性较大，除对细菌细胞膜造成损伤外，对动物细胞膜也起作用，主要对肾、神经系统有一定毒性。随着多肽类药物应用的增加，人们逐渐发现其在动物体内的残留，其可通过肉、蛋、奶等动物源性食品传递给人类，由此导致的食品安全问题日益受到人们的关注。近年来，我国研究人员还在大肠杆菌中首次发现质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1，突破了以往认为黏菌素不存在可转移耐药机制的观点。基于动物源肠杆菌对黏菌素耐药问题的日趋严重，且mcr-1首次被报道并在多个国家检测到之后，各国专家及相关部门开始正视黏菌素在畜禽中的使用可能带来的风险。我国农业部对黏菌素重新进行了风险评估，于2016年7月发布了“硫酸黏菌素停止用于动物促生长”的第2428号公告。此外，欧洲药品管理局也重新评估了黏菌素在动物中使用的风险，将黏菌素列为二线药物使用，并建议尽量减少黏菌素在动物中的使用。因此必须提高其分析检测技术水平，以加强对此类药物的残留检测与监控。本部分综述了多肽类药物的理化性质、药理学与毒理学、危害、国内外限量要求以及残留检测的样品前处理、仪器测定方法等内容，以期为该类药物的全面了解和残留检测提供参考。
1 理化性质
黏菌素（colistin，CLS）又名黏杆菌素、克利斯汀、多黏菌素E、抗敌素等，CLS的硫酸盐为白色或近白色粉末，无臭或几乎无臭、味苦，有引湿性，易溶于水，微溶于甲醇、乙醇，溶于丙酮、乙醚等，游离碱微溶于水，1%水溶液的pH为4.0～6.5。
杆菌肽（bacitracin，BAT）又名枯草菌素、枯草菌肽、崔西杆菌素，是一种多肽类药物，产生于特雷斯氏枯草杆菌和地衣芽孢杆菌。BAT实际上是几种相似多肽组分的混合物，通过其中的某些氨基酸来区别。BAT的结构是由12个氨基酸组成的含有噻唑环的多肽复合体，它是多种氨基酸结合而成的不稳定的多肽，有许多异构体，分别为BATA、BATA1、BATB、BATC、BATD、BATE、BATF1、BATF2、BATF3和BATG。以A为主的BATA结构是一种由12个氨基酸组成的含有噻唑环的多肽，分子中含有D-和L-氨基酸。这种独特的组成和独特的环状结构使BAT对各种蛋白质水解酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶等具有很大的抗性，同时也不受蛋白酶抑制剂的影响。与其他抗生素相比，BAT要稳定得多。锌可以提高BAT的稳定性和活性。BAT可与许多金属离子生成络合物，在干燥状态下较稳定。BATA由于极易吸潮和被分解，生产中在发酵达到BAT效价最高时，直接在培养液中加入硫酸锌或氯化锌，以生成较稳定的BAT-锌络合物，即BAT-锌。BAT是类白色至淡黄色的粉末，无嗅、味苦，有吸湿性，易被氧化剂破坏，在溶液中能被多种重金属盐类沉淀。BAT在水中易溶，在乙醇中溶解，在丙酮、三氯甲烷或乙醚中不溶。Craig等报道，高纯度的BAT不太稳定，但如果是活性很高的产品却非常稳定，在6℃存放2年活性无多大变化；在pH为4～7的水溶液中可稳定存在4周，但在强酸强碱中不稳定。
BAT-锌在室温下保存3年效价不变。饲料级BAT-锌每克含有BAT4.2万U，为淡黄色至淡棕黄色粉末。与天然BAT相比，BAT-锌的稳定性极为显著。在干燥状态下，其效价在室温下可保存3年不变，即使在酸性、碱性和热环境中，它的稳定性也较好。在温度达40℃时，BAT-锌保存24个月，它的有效成分仅损失10%；然而粪便中的BAT-锌在室温下3～6d后便开始分解，在堆肥中分解得更为迅速。
恩拉霉素（enramycin，ENR）是由包括13个不同种类的17个氨基酸分子和脂肪酸分子所组成的有机碱，其主要成分为ENRA和ENRB，此外还含有少量的ENRC和ENRD。ENR的盐酸盐为白色结晶粉末，相对分子质量约为2500，熔点为238～245℃，易溶于二甲基亚砜、稀盐酸，微溶于甲醇、含水乙醇，难溶于丙酮，不溶于苯、氯仿。ENR的盐酸盐对热、光照和潮湿有极好的稳定性。ENR在饲料中具有很高的稳定性，在室温条件下长期储藏很少降解，在制成颗粒料的过程中也非常稳定，与饲料混合后在室温下长期储藏效价下降甚微。ENR在肠道内不被降解，能够保持原有的抗菌活性，对革兰氏阳性菌有很强的抗菌作用。
维吉尼亚霉素（virginiamycin，VGM）又称为弗吉尼亚霉素，由两种天然组分M因子（多不饱和环状多肽）和S因子（环六肽内酯）组成。两种因子以大约4:l（M:S）的比例混合在一起形成VGM。为浅黄色粉末，有特臭，味苦。在三氯甲烷中易溶，在丙酮、乙醇中溶解，在水、乙醚中极微溶解。VGM稳定性好，室温保存3年效价不变。当添加到饲料中时，VGM经过粉碎、混合、高温（70～90℃）、蒸汽、制粒约30min等加工过程都可保持稳定效价，在肉鸡饲料中可保存6个月以上。
2 药理学与毒理学
硫酸CLS由多黏杆菌产生，属窄谱抗生素，对革兰氏阴性菌有较强的抗菌作用，敏感菌有绿脓杆菌、大肠杆菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、巴斯德氏菌和弧菌等。而变形杆菌属、布鲁氏菌属、沙雷氏菌属和所有革兰氏阳性菌均对本品耐药，故常用于治疗革兰氏阴性菌引起的肠道疾病。多肽类药物为慢效杀菌剂，主要作用于细菌细胞膜，能吸附在细菌的细胞壁上，与脂蛋白游离磷酸基结合，其化学结构中的游离氨基（带正电荷）与细菌细胞膜上磷脂的磷酸根（带负电荷）结合，破坏细胞膜的通透性，使细胞内重要成分特别是嘌呤、嘧啶等从细胞质中流出，使细菌生长受到抑制或引起细菌死亡。用CLS抑制禽分枝杆菌导出镁离子外流试验更加证明了其独特的作用机制，所以与其他类抗生素或抗菌药物不会产生交叉耐药性，但此类药物间会产生交叉耐药性。此类药物内服很少吸收，吸收后药物在体内分布较差，持续时间短暂。内服8h后除胆汁外，其他组织中仅有微量，16h后所有组织均无残留。注射后体内分布广，0.5～1h在主要组织中均达峰值，但不易向胸腔、关节腔和感染灶内渗透，也难以进入脑脊液中。6h后除血、气管、唾液腺、肾、尿外均不能检出，24h后除气管、肾、尿外也不能检出。药物的蛋白结合率较低，主要经肾排泄，肾功能不全时易在体内蓄积。CLS毒性较大，毒副作用表现多种，以肾毒性、神经毒性为主。CLS会影响及降低肾小球的过滤率，减少排尿量，对尿液中的电解质也会有影响，导致肾脏出现肾小管云雾状水肿。CLS是有效的组胺释放剂，与其他神经肌肉阻断剂同时使用时，偶尔会见到肌肉软弱无力、轻瘫，甚至呼吸停顿及全身瘫痪引起的死亡。CLS局部治疗时会出现耳毒性，但全身治疗时无耳毒性。神经毒性可能是CLS降低了肌肉对递质Ach的敏感性，产生类似局部麻醉的作用。临床主要用于治疗畜禽的大肠杆菌性腹泻和对其他药物耐药的细菌性腹泻。外用于烧伤和外伤引起的铜绿假单胞菌局部感染和眼、耳、鼻等部位敏感细菌的感染。CLS作为饲料药物添加剂有促生长作用。CLS与磺胺增效剂、BAT-锌等合用时可产生协同作用。
BAT本身可抑制、杀灭某些致病菌，当它与锌离子络合时，其抗菌活性会得到一定程度的增强。对革兰氏阳性菌具有高度抗菌活性，尤其对金黄色葡萄球菌和链球菌属作用强大，对某些螺旋体、放线菌属也有作用，对革兰氏阳性菌、肺炎双球菌、葡萄球菌、淋球菌、脑膜炎球菌及螺旋体等均有杀菌作用，对革兰氏阴性杆菌无效。其机理主要为使焦磷酸酶失活，从而特异性地抑制细菌细胞壁合成阶段的脱磷酸化作用，影响磷脂的转运和向细胞壁支架输送黏肽，从而抑制了细胞壁的合成。BAT尚可与敏感细菌的细胞膜结合，损伤细胞膜，致使各种离子、氨基酸等重要物质流失，还可干扰敏感细菌内原浆蛋白的合成，影响原生质体。BAT-锌对肾脏毒性大，一般不全身给药，注射时毒性强，而经口服时毒性极弱。BAT-锌对小鼠急性毒性LD50:静脉注射320～360mg/kg，腹腔注射420mg/kg，皮下注射1300～2500mg/kg，口服3700mg/kg。用精制BAT-锌产品试验，大鼠口服LD50为10000mg/kg，对小鼠为大于12500mg/kg。BAT全身应用时可引起严重的肾毒性反应，受损部位以肾小管最为明显，肾小球的滤过功能也受到抑制。BAT局部用药时有可能引起过敏反应，主要表现为皮肤局部瘙痒、皮疹、红肿或其他刺激现象，但一般反应轻微。
VGM可以通过革兰氏阳性菌的细胞壁而到达作用位点。在细菌细胞内，VGM的M因子和S因子结合到细菌核糖体50S亚基的23SrRNA上，形成稳定的M因子-核糖体-S因子复合物，从而不可逆地抑制细菌蛋白质的合成，最终导致细菌的死亡。两种组分单独存在时，仅有抑菌作用。M因子作用于蛋白质合成过程中肽链的延伸阶段，干扰肽酰转移酶的功能，并引起核糖体构象的改变，增加其对S因子的亲和性。S因子则阻断多肽链的延长，并引起未完成的肽链与核糖体脱离。蛋白质合成受阻使得某些必要的代谢过程中断，引起细菌生长受阻（抑菌作用）或死亡（杀菌作用）。口服后仅停留并作用于肠道，主要由粪便排出，残留量很小。对革兰氏阳性菌、肠球菌等有较强的抗菌作用，对支原体也有效，但对大多数革兰氏阴性菌无效。常用作猪、禽促生长添加剂。小剂量能促进畜禽生长，提高饲料转化率；中剂量可预防细菌性腹泻；高剂量用于防治鸡白痢、坏死性肠炎、猪痢疾。但欧盟从1999年开始禁止VGM作为促生长添加剂使用。对大鼠口服LD50为7500mg/kg，对小鼠以1550mg/kg的剂量一次性口服时，未发现有害反应，对猪一次性口服最大安全量为800mg/kg，以500mg/kg的剂量连续喂猪3个月无不良反应。
3 危害
多肽类药物的缺点为毒性较大，除对细菌细胞膜损伤外，对动物细胞膜也起作用，主要对肾、神经系统有一定毒性。随着多肽类药物应用的增加，人们逐渐发现其在动物体内的残留，可通过肉、蛋、奶等动物源食品传递给人类。
多黏菌素B的毒副作用表现有多种，以肾毒性、神经毒性为主。肾脏毒性是该类药物与肾小管上的磷酸根离子结合后引起损伤造成的，摄入少量时，多黏菌素B会影响及降低肾小球的过滤率，减少排尿量，导致肾脏出现肾小管云雾状水肿；摄入大量时，就会出现肾中毒，并能抑制人体补体系统。
4国内外限量要求
美国、日本和欧洲国家等曾将VGM和BAT-锌作为动物生长促进剂广泛应用于畜禽配合饲料中。1999年，出于对饲用抗生素在动物性产品中的残留问题的忧虑，欧盟禁止将VGM和BAT-锌作为促进动物生长用的饲料添加剂。我国农业部于2001年发布的?饲料药物添加剂使用规范?允许将VGM作为药物饲料添加剂在饲料中长时间添加使用，用于促进畜禽生长，但对其适用动物、用法用量和休药期等做出了明确规定。
中国：我国农业部于2002年12月24日发布的第235号公告对多肽类药物的MRL进行了规定。CLS在牛组织中的MRL，奶为50μg/kg，肌肉、脂肪、肝脏为150μg/kg，肾脏为200μg/kg；在羊组织中的MRL，奶为50μg/kg，肌肉、脂肪、肝脏为150μg/kg，肾脏为200μg/kg；在猪组织中的MRL，肌肉、脂肪、肝脏为150μg/kg，肾脏为200μg/kg；在鸡组织中的MRL，肌肉、脂肪、肝脏为150μg/kg，肾脏为200μg/kg，鸡蛋为300μg/kg；在兔组织中的MRL，肌肉、脂肪、肝脏为150μg/kg，肾脏为200μg/kg。BAT在牛、猪、禽的可食组织中的MRL，牛奶、禽蛋中的MRL均为500μg/kg。VGM在猪组织中的MRL，肌肉为100μg/kg，脂肪、肾脏及皮为400μg/kg，肝脏为300μg/kg，；在禽组织中的MRL，肌肉为100μg/kg，脂肪为200μg/kg，肝脏为300μg/kg，肾脏为500μg/kg，脂肪、皮为200μg/kg。
欧盟：欧盟对多肽类药物的MRL进行了规定。CLS在所有动物的肌肉、脂肪和肝脏中均为150μg/kg，在所有动物的肾脏中均为200μg/kg，在所有动物的奶中均为50μg/kg，在所有动物的蛋中均为300μg/kg。BAT在牛奶中为100μg/kg；在兔肌肉、兔脂肪、兔肝及兔肾脏中均为150μg/kg。
日本：日本对多肽类药物的MRL进行了规定。CLS在牛肉、猪肉中为0.3mg/kg，在其他陆生哺乳动物肉中为0.2mg/kg；在牛脂肪、猪脂肪中为0.3mg/kg，在其他陆生哺乳动物脂肪中为0.2mg/kg；在牛肝脏、猪肝脏中为0.3mg/kg，在其他陆生哺乳动物肝脏中为0.2mg/kg；在牛肾脏、猪肾脏中为0.3mg/kg，在其他陆生哺乳动物肾脏中为0.2mg/kg；在牛可食用下水、猪可食用下水中为0.3mg/kg，在其他陆生哺乳动物可食用下水中为0.2mg/kg；在鸡肉和其他家禽肉、鸡脂肪和其他家禽脂肪、鸡肝脏和其他家禽肝脏、鸡肾脏和其他家禽肾脏、鸡可食用下水和其他家禽可食用下水中均为0.2mg/kg；在鸡蛋和其他家禽蛋中均为0.3mg/kg；在鲑形目、鳗鲡目、鲈形目、其他鱼、有壳软体动物及其他水生动物中均为0.2mg/kg。BAT在牛肉、猪肉中为0.5mg/kg，在其他陆生哺乳动物肉中为0.2mg/kg；在牛脂肪、猪脂肪中为0.5mg/kg，在其他陆生哺乳动物脂肪中为0.2mg/kg；在牛肝脏、猪肝脏中为0.5mg/kg，在其他陆生哺乳动物肝脏中为0.2mg/kg；在牛肾脏、猪肾脏中为0.5mg/kg，在其他陆生哺乳动物肾脏中为0.2mg/kg；在牛可食用下水、猪可食用下水中均为0.5mg/kg，在其他陆生哺乳动物可食用下水中为0.2mg/kg；在奶中为0.mg/kg；在鸡肉和其他家禽肉、鸡脂肪和其他家禽脂肪、鸡肝脏和其他家禽肝脏、鸡肾脏和其他家禽肾脏、鸡可食用下水和其他家禽可食用下水、鸡蛋和其他家禽蛋中均为0.5mg/kg。ENR在猪肉、猪脂肪、猪肝脏、猪肾脏、猪可食用下水、鸡肉、鸡脂肪、鸡肝脏、鸡肾脏、鸡可食用下水中均为0.03mg/kg。VGM在牛肉、猪肉、其他陆生哺乳动物肉中均为0.1mg/kg；在牛脂肪中为0.2mg/kg，在猪脂肪中为0.3mg/kg，在其他陆生哺乳动物脂肪中为0.1mg/kg；在牛肝脏中为0.2mg/kg，在猪肝脏中为0.3mg/kg，在其他陆生哺乳动物肝脏中为0.2mg/kg；在牛肾脏中为0.2mg/kg，在猪肾脏中为0.3mg/kg，在其他陆生哺乳动物肾脏中为0.2mg/kg；在牛可食用下水、猪可食用下水、其他陆生哺乳动物可食用下水中均为0.2mg/kg；在奶中为0.1mg/kg；在鸡肉中为00.5mg/kg，在其他家禽肉中为0.1mg/kg；在鸡脂肪和其他家禽脂肪、鸡肝脏和其他家禽肝脏、鸡肾脏和其他家禽肾脏、鸡可食用下水和其他家禽可食用下水中均为0.2mg/kg；在鸡蛋和其他家禽蛋中为0.1mg/kg。
韩国：韩国对多肽类药物的MRL进行了规定。BAT在牛肉、鸡肉及猪肉中均为0.5mg/kg。VGM在鸡肉、猪肉中均为0.1mg/kg。蛋牛奶中均为0.5mg/kg。VGM在牛可食用下水、牛脂肪中均为0.2mg/kg，在牛肉、牛奶、蛋中均为0.1mg/kg；在猪可食用下水、猪脂肪中均为0.2mg/kg；在猪肉中为0.1mg/kg；在家禽可食用下水、家禽脂肪中为0.2mg/kg；在家禽肉中为0.1mg/kg；在绵羊可食用下水中为0.2mg/kg，在绵羊肉中为0.1mg/kg。
美国：美国对多肽类药物的MRL进行了规定。BAT在牛、猪、鸡、火鸡、野鸡和鹌鹑的可食用组织及乳、牛奶、蛋中均为0.5mg/kg。VGM在猪肾脏、猪皮、猪脂肪中均为0.4mg/kg，在猪肝脏中为0.3mg/kg，在猪肉中为0.1mg/kg。
5 品前处理方法
5.1 饲料样品
目前，抗生素的分离纯化主要采用溶剂萃取和吸附交换的方法，饲料中ENR的萃取方法可先用碱性正丁醇萃取，再用酸性水溶液进行反萃取。吸附交换的方法可采用活性炭和大孔吸附树脂，活性炭在碱性条件下（pH＞8）可吸附ENR，再用酸性含水甲醇洗脱，而大孔吸附树脂在中性或碱性甲醇溶液中可吸附ENR，再用酸性甲醇来洗脱。由于ENR在阳离子或阴离子树脂中都不吸附，因此无法使用离子交换树脂来分离纯化ENR。大孔吸附树脂是一类不含离子交换基团的交联聚合物，理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，对有机物有浓缩、分离作用，且不受无机盐类及强离子、低分子化合物的干扰。其本身由于范德华力或氢键的作用具有吸附性，又具有网状结构和很高的比表面积而有筛选性能，是一类不同于离子交换树脂的吸附和筛选性能相结合的分离材料。有人采用多孔苯乙烯-二乙烯苯聚合物大孔吸附树脂（amberlite XAD-2）对ENR样品进行层析，成功地分离出了ENRA和ENRB组分，同时采用梯度洗脱法对ENRA和ENRB进行了定量分析。
顾欣等建立了用微生物学法测定饲料中ENR含量的方法，采用大孔吸附树脂来对饲料中的ENR进行分离纯化。饲料样品经酸性甲醇溶液提取，大孔吸附树脂层析柱吸附洗脱后，饲料中的ENR得到很好的分离纯化。在饲料样品提取时，因ENR微溶于水和纯甲醇，但溶于酸性水和含水甲醇，且ENR在酸性条件下非常稳定，所以采用pH为3.0的50%甲醇溶液作为提取液，方法回收率较高。
佟斌等建立了用超声波提取饲料中的硫酸CLS的前处理方法。取饲料样品粉碎过筛，充分混匀备用。5g饲料加入150mL10%的甲醇溶液，超声波提取20min，70℃旋转蒸发器蒸干，用去离子水5mL溶解残渣，高效液相色谱检测。并且研究不同浓度甲醇对提取效率的影响，在固定液料比为30:1、超声提取时间为20min的条件下，使用不同浓度的甲醇对硫酸CLS回收率影响较大。硫酸CLS在纯水中最易溶出，随着甲醇浓度的增大，硫酸CLS的溶出受到明显抑制。但是纯水中杂质溶出比较多，当使用10%的甲醇溶液作为提取液时可以显著抑制杂质的溶出，并且与纯水回收率相差很小。超声作用时间对回收率也有很大影响。在以10%甲醇为提取液、固定料液比为1:30的条件下，进行不同的超声作用时间，结果表明随着超声作用时间的增加，回收率逐渐增大，但当超声作用时间达到20min后，回收率几乎不变，此时如果继续增加超声作用时间，反而会增加杂质的溶出。
5.2 动物组织
提取是指用物理或化学的手段破坏待测物组分与样品成分间的结合力，将待测物组分从样品中释放出来，并转移到易于分析的液体状态。提取方法的设计应考虑样品性质、样品基质的种类、待测物溶解性、提取溶剂及可能采用的净化方法等。在整个样品处理过程中，提取过程应首先保证将待测物最大限度地从样品中释放出来，保证最高回收率，其次是减少样品基质成分的混入，提取溶剂主要有甲醇-磷酸二氢铵、甲醇、甲醇-乙腈、乙酸乙酯、乙腈等。
净化是指将提取液中的待测物组分与提取过程中一起进入的与待测物组分溶解性相似的杂质分离的过程。一般来说，提取过程可除去绝大多数样品基质，剩下与待测物组分共存的主要是一些干扰杂质。这些干扰杂质可干扰光谱检测和色谱分离过程，增加基线噪声、降低柱效、污染色谱柱和检测器，一些杂质可能会影响衍生化反应，如水分等含活泼质子的杂质可抑制硅烷化反应和酰化反应，降低衍生化产物的稳定性。为保证分析方法定量和定性的正确性，必须通过净化过程除去杂质。净化过程十分复杂，一般主要基于待测物的理化性质并结合使用多种分离方法设计净化程序。在样品净化方法的选择上，应用较多的是液-液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）两种方法。利用原料液中各组分在适当溶剂中溶解度的差异而实现混合液中组分分离的过程称为LLE，又称溶剂萃取。LLE是20世纪30年代用于工业生产的新的液体混合物分离技术。随着萃取应用领域的扩展，回流萃取、双溶剂萃取、反应萃取、超临界萃取及液膜分离技术相继问世，使得萃取成为分离液体混合物很有生命力的操作单元之一。
SPE是利用固体吸附剂将液体样品中的待测物吸附，使其与样品的溶剂和干扰物质分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集待测物的目的。SPE的主要分离模式与液相色谱相同，可分为正相、反相和离子交换固相萃取。多肽类药物常用的SPE净化方法包括C18固相萃取、基质分散固相萃取、硅胶＋HLB固相萃取等。
Ikai报道了CLS的C18SPE柱净化方法，采用甲醇、水进行平衡，用水、15%乙腈（含0.1%TFA）、乙腈-0.017mol/LTFA（20:80）进行洗脱，洗涤液对除去杂质很有效，回收率为64%，检测限为0.2μg/g，该方法获得的较低的回收率可能与待测物吸附和提取过程中基质的共沉淀有关。
Decolin等建立了CLS衍生化高效液相色谱荧光检测法，组织样品（牛肌肉、肝、肾、脂肪）的提取溶剂为甲醇-10%TCA（50:50），提取乳汁则仅使用10%TCA，提取液经甲醇-0.01mol/L盐酸（55:45）洗脱，OPA试剂衍生化，在线C18柱净化后测定，回收率为62%～78%，检测限为0.002（乳）～0.02μg/g。CLS与组织结合较强，提取液中加入TCA可沉淀蛋白质和解离药物，固体样品需同时加入甲醇以改善提取效率。硫酸CLS在机体内存在的形式有两种:一种是游离状态，另一种是结合状态。游离状态药物通过组织匀浆可提取。Kunin和Bugg报道，结合状态药物可用2倍体积的氯仿:甲醇（2:1）提取，65℃旋转蒸干，0.1mol/L硫酸室温溶解30min，用0.1mol/L氢氧化钠中和调节pH。Kazuo等报道结合状态药物可用5%盐酸和甲醇经过3次提取，并于45℃旋转蒸干。
林维宣等建立了一种可同时测定牛奶多黏菌素B、CLS、BAT和VGM4种多肽类药物残留量的LC-MS/MS检测方法。样品经甲醇-0.1%甲酸体系提取、正己烷脱脂、SPE柱净化后，利用LC-MS/MS进行定性和定量分析。具体方法如下：称取牛奶样品5.0g于50mL具塞离心管中，加入25mL提取液（1000mL0.1%甲酸水溶液和400mL甲醇，混合均匀）后，加入1mL盐酸（浓度为6mol/L），涡旋混匀，离心10min。转移上清液至另一离心管中，残渣中加入20mL提取液重复以上提取操作。合并2次提取上清液后，加入正己烷20mL涡旋2min，离心10min，去掉上层液。下层液中再加入正己烷20mL重复以上脱脂操作。所得下层液待净化。将上述所得样品提取液转移至OasisHLB净化柱（用甲醇和水各6mL预洗活化），先用10mL水洗涤，弃去流出液，再用3mL甲醇洗脱，收集洗脱液并于40℃水浴条件下氮气吹干。样品用标样溶解液复溶并定容到1.0mL后，混匀，过0.45μm滤膜，供LC-MS/MS测定。研究者对样品提取溶剂和净化条件的选择进行了研究。试验比较了甲醇-0.1%甲酸水溶液和甲醇-磷酸二氢铵溶液的提取效果，结果前者提取效果较好。考虑到多肽类药物在酸性条件下稳定，而磷酸盐会对质谱产生不良影响，所以最终选择甲醇-0.1%甲酸水溶液作为提取溶剂。比较了甲醇和0.1%甲酸水溶液不同比例的提取效果，结果表明，当甲醇和0.1%甲酸水溶液体积比为2:5时提取效果最佳。由于乳制品中蛋白质含量很高，加入一定量的盐酸可有效地去除蛋白质等杂质。通过试验选择了OasisHLBSPE柱（规格500mg/6mL）净化，该SPE柱的填料是一种新型反相吸附剂，具有亲水亲脂平衡特性，可以保持其在水中湿润，并且对极性和非极性化合物有很宽的适用范围，试验表明，该净化柱具有较好的净化效果。
林维宣等同时也建立了动物组织（肌肉、肝脏、肾脏）中CLS、BAT和VGM等多肽类药物残留量的检测方法。样品经甲醇-0.1%甲酸提取，OasisHLBSPE柱净化后，利用LC-MS/MS进行定性、定量分析。样品前处理如下:称取已切碎的样品5.0g（精确至0.01g）于50mL具塞离心管中，加入提取液25mL，均质2min后，4℃下离心10min。转移上清液至另一离心管中，残渣中加入20mL提取液重复以上提取操作。合并2次提取上清液后，加入正己烷20mL涡旋2min，离心10min，弃去上层液。下层液中再加入己烷20mL重复以上脱脂操作，所得下层液待净化。将上述所得样品提取液转移至OasisHLB净化柱，先用10mL水洗涤，弃去流出液，再用3mL甲醇洗脱，收集洗脱液，于40℃水浴条件下氮气吹干。试样用标样溶解液复溶并定容到10mL后，混匀，过0.45μm滤膜，供LC-MS/MS测定。
谢明权等对ENR在鸡组织中的残留提取进行了研究。肾和肌肉组织样品用胃蛋白酶溶液消化后，用甲醇和盐酸混合溶剂进行抽提，离心取上清液。上清液加乙醚用力摇动，分离出甲醇盐酸层，然后浓缩，再加胃蛋白酶至剩下的溶液中，静置过夜后通过XAD-2柱，并用甲醇及盐酸混合溶剂洗提，抽提液用0.1N氢氧化钠中和，加进氯化钠使其呈饱和状态，用正丁醇抽提去盐后，将正丁醇层浓缩至干，残留物溶解在80%甲醇中。肝及脂肪的抽提，省去抽提中使用胃蛋白酶的预先处理。血浆的抽提，用胃蛋白酶作用，其后按肾的提取法进行处理。经薄层色谱及枯草杆菌ATCC6633生物显像，进行定性及定量分析。
有关动物组织中VGM残留检测方法研究的文献报道不多，主要利用经典的液-液分配法提取组织样品中残留的VGM，再用HPLC进行检测。鉴于商品VGM是以VGM-M1组分为主，文献报道的动物组织中VGM残留检测方法研究主要针对VGM-M1组分。耿志明等研究了利用SPE进行样品前处理，反相HPLC测定猪组织中VGM-M1残留的检测方法。样品前处理为:称取2.5g左右已切碎的组织样品，放入50mL离心管中。加入15mL甲醇，用组织分散器分散30s，少量甲醇洗涤刀头，再加入10mL0.2mol/L NH4H2PO4溶液，混合均匀后离心10min（5000r/min）。将上清液转移至125mL分液漏斗中，用20mL正己烷洗涤。下层液转移至50mL茄形瓶中，45℃恒温水浴减压浓缩至2mL左右，加入4mL40%甲醇溶液，摇匀后上C18SPE柱（预先活化），用5mL40%甲醇溶液洗涤，用5mL80%甲醇水溶液洗脱。洗脱液45℃恒温水浴，氮气吹至近干。用250～500μL流动相溶解，过滤膜供HPLC分析。
陈小霞等建立了牛奶、鸡蛋、鸡肉、鸡肝、鸡肾、猪肾和牛肾样品中VGM-M1残留检测的LC-MS确证方法。用乙腈萃取样品中的VGM-M1残留，用水稀释后，正己烷脱脂，直接进样分析，在正离子模式下采用电喷雾电离串联质谱仪进行测定。样品处理如下:称取1g试样（精确到0.01g），置于15mL具塞离心管中，加入3mL乙腈，涡旋混合1min，冰水浴超声提取5min。以3000r/min低于15℃离心5min，收集上清液于有刻度离心管中。离心后的残渣用2mL乙腈重复上述步骤提取1次，合并上清液，用水稀释定容至10mL，混匀。加入4mL正己烷，混合1min，3000r/min以上低于15℃离心5min，下层溶液过0.22μm滤膜后供LC-MS/MS仪测定。试验发现，直接采用乙腈超声提取不仅可减少脂肪等杂质，而且回收率较高；样品提取液经水稀释后用正己烷净化，即可达到净化要求，不仅避免了繁琐的SPE净化步骤，而且降低了检测成本，提高了检测效率。
Della等用LC-MS/MS分析了牛奶、动物组织样品中BAT、CLS主要成分的残留量。牛奶经三氯乙酸去蛋白质并离心净化，动物组织则借助SPE净化，以多黏菌素B为内标，RP-HPLC柱分离，进行质谱扫描。Poucke等利用LC-MS对BAT-锌、VGM等饲料添加药物进行了定量检测，2.5g饲料经甲醇-水体系萃取后，再用OASISSPE小柱净化、C18柱分离检测。
6 检测方法
6.1 微生物法
微生物法是多肽类药物残留检测中应用较广的一种检测方法，它是根据抗生素对微生物生理机能和代谢的抑制作用来定性或定量地确定样品中的兽药残留。微生物法有杯碟法、拭子法及纸片法，主要应用的是杯碟法，它是准确测定多组分药物效价最可靠的方法。杯碟法是微生物法中较常用的一种方法，我国行业标准SN/T1134—2002就是利用杯碟法检验进出口肉及肉制品中VGM的残留，该方法的测定低限为0.05mg/kg，鸡肉中VGM添加浓度分别为0.05mg/kg、0.10mg/kg、0.20mg/kg时，回收率分别为80.0%、81.0%、81.3%，准确度较好。
关于检测菌株，美国药典（USP）和英国药典（BP）、欧盟规定用支气管炎博代特氏菌（Bordetella bronchiseptica）ATCC4617，中国药典规定用大肠杆菌（Escherichia coli）CMCC（B）44103作为检测硫酸CLS含量的标准菌株。Harada等用支气管炎博代特氏菌ATCC4617检测硫酸CLS残留，最低检测限为0.05μg/g。
温芳等建立了硫酸CLS残留检测的微生物学方法。以支气管炎博代特氏菌ATCC4617作为检测菌株，用PBS提取鸡肌肉组织中的硫酸CLS，用5%硫酸提取鸡肝脏和肾脏组织中的硫酸CLS，应用剂量法设计原理制备肌肉、肝脏和肾脏组织标准曲线。硫酸CLS检测限肌肉组织为0.15μg/g，肝脏和肾脏组织均为0.20μg/g，肌肉、肝脏和肾脏组织标准曲线在0.025～6.4μg/mL范围内线性关系良好，相关系数分别为0.997、0.9994、0.999。
ENR的主要成分为ENRA和ENRB，还有少量的C和D组分。对于多组分发酵抗生素的含量测定，国际上通常采用管碟法。美国AOAC采用此法检测饲料中BAT、金霉素、莫能菌素、新霉素、泰乐菌素等大多数抗生素的药物含量，而我国测定饲料中吉他霉素、盐霉素、林可霉素等含量的国家标准也采用此法。顾欣等建立了用管碟法测定饲料中ENR含量的方法，采用大孔吸附树脂来对饲料中的ENR进行分离纯化。方法采用枯草杆菌为检验菌，饲料中ENR的最低定量限为0.5mg/kg，标准曲线的线性范围为0.4～12.8μg/mL，相关系数为0.9991，回收率大于85%，RSD小于15%。
根据ENR对革兰氏阳性细菌能产生有效抑制的原理，采用微生物抑制法试验，绘制抑菌圈直径对应ENR效价的标准曲线。万文倩等建立了用微生物法测定ENR发酵液生物效价的方法。试验以枯草杆菌为工作菌，用杯碟法测定ENR的效价。结果表明:ENR的最低检出限为21.47μg/mL，平均回收率均超过97.5%，并且检测时间仅需16h。该法能快速检测ENR效价且灵敏度高、操作简便、回收率高。微生物法测定ENR的效价准确且方便。通过抑菌圈试验检测ENR效价的标准曲线，并验证了该法的稳定性与重复性，同时与HPLC进行比较，结果表明:该法的重复性较好，并且检测结果与HPLC相对偏差较小。由于微生物法操作简便、成本低，相对于HPLC对于仪器设备的要求低，因此可采用微生物法代替HPLC检测发酵液中ENR的含量。
微生物法成本低、操作简便、具有一定的灵敏度，在同时分析大批样品中具有一定优势。但该方法分析速度慢、专一性差，并且只能测定有生物活性的残留物。微生物法中影响测定结果准确性的因素较多，其中平板间的差异是影响方法准确度和重复性的关键问题。影响平板间差异的主要因素有平板是否铺平、牛津杯的加样量是否一致、接种物与培养基是否混合均匀等。
6.2 免疫分析法
免疫分析法是以抗原抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术，主要包括放射免疫法（RIA）、ELISA、荧光免疫测定法和免疫电镜技术等，其中在残留分析中应用最多的是ELISA和RIA。一些大分子物质（如蛋白质、酶）属于结合抗原。小分子化合物（相对分子质量通常低于5000）不具备免疫原性，不能直接刺激动物产生抗体，必须与大分子载体物质（如蛋白质）连接后才能产生相应抗体，即具有反应原性，这类小分子物质称为半抗原。绝大多数药物属于这类物质。因此药物残留分析中能否合成稳定、具有良好免疫原性的药物与载体蛋白结合物是关键。
Kitagawa等建立了虹鳟组织中CLS的ELISA，采用CLS-蛋白质共轭物免疫兔，获得CLS抗体，将药物的一个氨基结合到牛血清白蛋白（BSA）的硫醇基上，用N-（m-顺丁烯二酰亚胺苯甲酰）琥珀（MBS）做交联剂共轭。上述反应在室温和近中性介质中进行，反应时间为0.5～2h。利用建立的方法测定CLS在虹鳟体内的分布，方法的回收率为100.0%～102.4%，检测限为30ng/mL。
Matsumoto等曾用ELISA测定了鸡血中BAT的残留量，即用辣根过氧化物酶为酶标记物，以BAT抗体IgG测试条进行检测。该法简便快速，检测限为1ng/mL，回收率为97%～103%。Williams等则利用ELISA对动物饲料中BAT-锌在储藏过程中的稳定性情况进行了监测，即将BAT-锌的各组分分离出来，用ELISA分析各组分与抗体的反应情况。
ELISA特异性强、灵敏度高、快速简便，可准确地定性、定量，适用于现场检测和大量样品的快速检测，是一种较理想的兽药残留筛查方法。未来兽药残留分析技术中的免疫分析法将向试剂标准化、使用更灵敏和抗干扰性强的标记物以及与理化分析技术联用方向发展。目前，国内所采用的兽药残留免疫分析法基本上都是ELISA，国外陆续报道了化学发光免疫技术、电化学发光免疫技术、荧光免疫分析及生物传感器等先进技术，这些方法都有更加广泛的应用前景。
6.3 高效液相色谱（HPLC）
HPLC又称高压液相色谱、高速液相色谱、高分离度液相色谱、近代柱色谱等。HPLC是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱中，各成分在柱内被分离后进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、进出境检验和法定检验等学科领域中重要的分离分析技术。已报道的多肽类药物的检测方法包括直接紫外检测法和荧光衍生化检测法。CLS主成分结构中具有多个伯胺基团，能与C18填料中残留的硅醇基发生强烈相互作用，导致峰拖尾或峰形异常，所以流动相一般呈酸性，需含有高浓度的盐或隐蔽剂以抑制硅醇基的吸附活性。Ikai分别使用挥发性的有机物（TFA）代替无机盐或酸，并对不同孔径及粒度的C18和反相聚合物固定相进行比较。结果表明大孔径填料和不含硅醇基的苯基填料的分离效果较好，峰形尖锐。大孔径填料可能有利于CLS的自由扩散，传质阻力较小。
Cancho等建立了饲料中CLS柱前衍生化-荧光检测法。CLS采用0.1mol/L盐酸进行声裂法和振荡提取，进行柱前衍生化，用酞二醛和2-巯基乙醇在硼酸盐缓冲剂（pH10.5）中进行衍生化反应。色谱柱为树脂型滤芯5μmODS柱，用乙腈-超纯水（75:25）作为流动相。荧光检测器的激发波长340nm、发射波长440nm，检测时间低于20min，结果表明无杂质干扰。Morovj等建立了用反相HPLC柱后衍生化测定饲料中CLS和4种AGs的荧光检测法。采用稀盐酸声裂法和振荡法提取药物，利用邻苯二甲醛进行柱后衍生化。流动相为乙腈-水溶液、硫酸钠-Tris溶液（pH2.8），这种检测方法也适用于某些药物制剂中药物含量的检测，也适合动物组织和血浆中的残留检测和药动学研究。
Decolin等建立了CLS衍生化HPLC荧光检测法方法，提取液经甲醇-0.01mol/L氯化氢（55:45）洗脱，OPA试剂衍生化，在线C18柱净化后测定，回收率为62%～78%，检测限为0.002（乳）～0.02μg/g。此外，一些高端检测器如光电二极管矩阵检测器（PAD）也应用到多肽类药物的残留检测中。耿志明等利用PAD对RP-HPLC分离分析的鸡组织中VGM-M1的残留进行检测，色谱条件为:波长为245nm；色谱柱为ODS-3C18柱；流动相为乙腈-水（37.5:62.5，V/V）。该方法对肌肉、肝脏和肾脏等不同鸡组织中3种VGM-M1浓度进行回收测定。结果表明该方法在鸡组织中的回收率为74.5%～91.1%；批内、批间变异系数均在10%以内；最低检测限均为10μg/kg。同时采用PAD建立了用HPLC测定猪组织中VGM-M1残留的方法。色谱条件为:波长245nm；色谱柱为ODS-3 C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相为乙腈-水（37.5:62.5，V/V）。VGM-M1标准曲线线性范围在0.1～2.0μg/mL。该方法对不同组织的3种加药浓度进行回收率测定，回收率为72%～85%，变异系数在10%以内，最低检测限为10ng/g。
6.4 液质联用（LC-MS）
近年来，随着分析仪器的现代化、定性与定量技术的不断进步，LC-MS在兽药残留分析研究中得到了广泛应用。
联用技术一般是指色谱仪（GC或LC）与质谱（MS）、红外光谱、核磁共振波谱等联机用于分离与定性的技术。就GC而言，常见的联用仪器有GC-MS和GC-FTIR。色谱法具有高效的分离能力和高灵敏度的定量检测能力，但仅显示色谱峰和保留值，不能提供待测物组分的结构信息或对未知化合物进行结构鉴定。MS、红外光谱、核磁共振波谱等具有很强的结构鉴定能力，但只适用于纯物质的分析，自身不具备分离能力。两者结合特别是联用仪器可以集高效分离和结构鉴定于一体，成为复杂混合物中痕量组分定性和定量的有效工具。
LC-MS是一种集高效分离和多组分定性、定量于一体的分析系统。HLPC-MS以HPLC作为分离系统、MS为检测系统。样品在MS部分和流动相分离，被离子化后，经MS的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。LC-MS体现了色谱和MS优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在药物分析、食品分析和环境分析等许多领域得到了广泛的应用。
Della等用LC-MS/MS分析了牛奶、动物组织样品中BAT、CLS主要成分的残留量。牛奶经三氯乙酸去蛋白质并离心净化，动物组织则借助SPE净化后，以多黏菌素B为内标，RP-HPLC柱分离，在MRM模式下进行质谱扫描。BATA、CLS-A和CLS-B定量限为100μg/kg和509μg/kg。在所有样品中，批间（n＝7）和批内（n＝4）回收率分别为89.2%～110%（RSD＜10%）和90.4%～112%（RSD＜13%）。Poucke等利用LC-MS对BAT-锌、VGM等禁用的动物饲料添加剂进行了定量检测，2.5g饲料经甲醇-水体系萃取后，再用OASIS SPE小柱净化、Kromasil C18柱检测，该方法可检测含量低于1mg/kg的样品。
林维宣等建立了一种可同时测定多黏菌素B、CLS、BAT和VGM4种多肽类药物残留量的LC-MS/MS检测方法。结果表明，该方法4种多肽类药物检出限分别为多黏菌素B250μg/kg、CLS 25μg/kg、BAT50μg/kg、VGM20μg/kg，平均回收率分别为多黏菌素B92.16%～95.89%、CLS 92.24%～97.87%、BAT 94.54%～97.96%、VGM 93.58%～98.25%，变异系数为2.54%～6.55%。Govaerts等利用HPLC与离子阱质谱（ion trap mass spectrometry，ITMS）联用技术对线性和环状多肽抗生素（多黏菌素B、CLS、BAT、BAT）中的微量组分进行了检测分析，这种LC-MS的检测方式在简化分离纯化过程的同时，又得到了较详尽的结构分析结果，能够快速高效地达到检测目的。
陈小霞等建立了牛奶和鸡蛋样品中VGM-M1残留的液质联用确证方法。样品处理后在正离子模式下以电喷雾电离串联质谱仪进行测定。方法的线性范围为2.5～25μg/L，定量下限为50μg/kg，添加回收率为72%～99%，相对标准偏差为2.7%～6.1%。同时建立了鸡肉、鸡肝、鸡肾、猪肾和牛肾样品中VGM-M1残留的液质联用确证方法。样品分离纯化后在正离子模式下采用电喷雾电离串联质谱仪进行测定。方法的定量限分别为鸡肉25μg/kg、鸡肝100μg/kg、鸡肾100μg/kg、猪肾150μg/kg、牛肾100μg/kg，方法的回收率分别为鸡肉86.8%～108%、鸡肝81.8%～109%、鸡肾85.5%～102%、猪肾82.7%～102%、牛肾80.7%～103%，RSD分别为鸡肉4.3%～6.7%、鸡肝3.3%～7.3%、鸡肾2.8%～4.6%、猪肾1.9%～4.1%、牛肾3.4%～6.9%。
王贤玉等建立了牛奶、鸡蛋及猪组织中CLS、多黏菌素B及BAT3种多肽类药物残留的HPLC-电喷雾电离串联质谱残留检测确证方法。牛奶、鸡蛋和猪可食用组织样品经过5%高氯酸提取，上清液用乙醚进一步去除色素和脂类杂质，离心，去除乙醚层，过Strata-X柱净化，上机检测。CLS、多黏菌素B、BAT在牛奶中的检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为1.9μg/L、4.0μg/L、0.6μg/L和6.2μg/L、13μg/L、2.1μg/L；鸡蛋中LOD和LOQ分别为2.1μg/kg、4.5μg/kg、1.3μg/kg和7.1μg/kg、15μg/kg、4.5μg/kg；肌肉中LOD和LOQ分别为3.4μg/kg、4.9μg/kg、1.6μg/kg和11μg/kg、16μg/kg、5.3μg/kg；肝脏中LOD和LOQ分别为2.6μg/kg、4.6μg/kg、3.8μg/kg和8.6μg/kg、15μg/kg、13μg/kg；肺脏中LOD和LOQ分别为2.9μg/kg、1.6μg/kg、.55μg/kg和9.7μg/kg、5.2μg/kg、18μg/kg；肾脏中LOD和LOQ分别为3.7μg/kg、4.9μg/kg、2.5μg/kg和12.3μg/kg、16.2μg/kg、8.2μg/kg。牛奶样品，添加20μg/L、100μg/L、500μg/L3个水平，按照上述方法处理，3种药物的回收率、批内变异系数、批间变异系数分别为:CLS，73.4%～90.8%、4.2%～9.9%、8.0%～11%；多黏菌素B，76.0%～87.5%、3.0%～8.8%、5.9%～16%；BAT，78.6%～86.5%、4.2%～12%、8.6%～16%。
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| 文章作者：曲志娜 赵思俊等 中国兽医发布 文章编辑：一米优讯 |
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