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近年来,兽药特别是抗生素在畜牧生产中的应用增加,由此导致的动物性食品中兽药残留问题日益突出。兽药残留分析是复杂混合物中痕量组分的分析技术。残留分析既需要精细的微量操作手段,又需要高灵敏的痕量检测技术,难度大、仪器化程度和分析成本高,分析质量控制和分析策略(如筛选性分析、确证性分析)有特殊要求。现对兽药残留分析中分离和检测技术现状及发展动向做一简要介绍。
1 样本前处理
1. 1 提取
提取是使用适当溶剂将待测物连同部分样本基质从固态样本转至易于净化或分析的液态,通常可除去99%的样本杂质。根据样本的性质选择溶剂,如脂肪或水分含量。使用水溶性有机溶剂(乙腈、甲醇、丙酮等)有许多优点:溶剂和动物样本易混合,提取速度快;溶剂溶解作用强;提取液pH值可以调节,适用范围广;提取的同时兼脱蛋白和脱脂;待测物在样本提取液中均匀分布,可只移取部分上清液或滤液进行分析,无需
反复提取将待测物全部转出。
1. 2 净化
净化即将待测物与提取液中的样本干扰杂质分离。前处理中净化的工作量最大,但一个具有强大分离效能或高选择性检测能力的测定体系可大大降低对净化的要求。兽药残留分析中常用的净化方法是液- 液分配和固相萃取。
1. 2. 1 液- 液分配
液- 液分配属经典的净化手段。等体积的分配体系中溶质分配平衡后溶解在非极性或极性较弱的溶剂中溶质的百分比称为p值,利用p值可以选择萃取系统、计算萃取次数和抽出率。通过调节溶液的pH值、极性、离子对形成等手段选择性地改变待测物的p值是常用的净化方法,如组织中磺胺类药物的净化[ 1 ]。多数兽药属有机酸或有机碱类化合物,离子对萃取法在兽药残留分析中有重要价值。
1. 2. 2 固相萃取
固相萃取作为净化手段,其基本原理与开放式柱色谱相同。固相萃取中样本与微细颗粒填料(Φ70～150μm)接触面积大,净化速度快,分离效能高;操作简便,溶剂用量少,回收率高。所以近年来固相萃取发展很快。吸附层析常用的填料如硅胶、氧化铝,因其吸附性能受自身和样品的含水量影响很大,需严格控制。大孔树脂(聚苯乙烯)为一种反相吸附剂,可直接净化含水试样。分配层析中常用的反相填料为键合有十八烷基(C18)或辛烷基(C8)的硅胶,是目前应用最普遍的固相萃取技术。
基质固相分散(matrixsolid - phasedispersion, MSPD ) 是1989年由美国Louisiana州立大学的S A Barker教授首次提出并给予理论解释的一种崭新的固相萃取技术。其基本操作是将样本直接与适量反相填料(C18或C8)研磨、混匀,制成半固态装柱、淋洗。作为样本净化技术,它具有直接处理样本的优点,快速的分离过程和较高的分离效能,特别适宜于多残留组分快速分离和分析自动化。MSPD的简单操作中浓缩了传统的样本前处理中所需的样本匀化、组织细胞裂解、提取、净化等过程,但避免了样本匀化、转溶、乳化、浓缩和静电造成的待测物损失;净化后的样品可直接进行测定,测定速度快(十几分钟) ,所用有机溶剂量减少(几十毫升) 。
1. 2. 3 薄层色谱( TLC)
TLC作为样本净化手段具有直观、速度快、样本容量大和分离效能高(颗粒Φ30～50 μm)等优点。但对紫外- 可见区无吸收的待测物却难以定位,有些待测物可通过标准品显色来解决。
1. 3 浓缩
浓缩是待测物富集或转溶的常用方法。前处理中以浓缩过程待测物损失最大。应避免样品液被直接蒸干,否则待测物可能附着于器皿上或与样本基质结合使回收率下降,高极性待测物如磺胺类药物较为严重。
1. 4 衍生化
衍生化提高检测的灵敏度和选择性已成为残留分析中衍生化的最主要目的,如给待测物连接强电负性基团以适于气相色谱的电子捕获检测器检测、HPLC的紫外或荧光衍生化等。
HPLC衍生化分为柱前和柱后衍生化。柱后衍生化需要专门的反应装置(高压泵、混合及反应管道) ,待测物从色谱柱流出后与衍生化试剂反应,再进入检测器。其突出优点是在线反应,动态检测,无需反应进行完全,不影响现有的分离条件;主要不足是衍生化试剂可能对检测有干扰,对流动相亦有限制。
2 测定方法
2. 1 气相色谱法
气相色谱法有许多高灵敏、通用性或专一性强的检测器供选用,如氢焰离子化检测器( FID) 、氮磷检测器(NPD)等,检测限一般为μg/kg级。但是大多数兽药极性或沸点偏高,需繁琐的衍生化步骤,限制了GC的应用。所以, 20 世纪80 年代后HPLC的发展速度超过GC,相当数量的兽药采用或改用HPLC进行分析,如氯霉素、磺胺类药物等。
2. 2 高效液相色谱法
几乎所有的化合物包括高极性/离子型待测物和大分子物质均可用HPLC进行测定。HPLC的分离机制与常规柱色谱相同,但填料更加精细(Φ5～10μm) ,可重复进样,分析速度快。HPLC至今仍缺乏可满足兽药残留分析要求的通用型检测器。紫外检测器(UVD)最普及,其次是荧光检测器和电化学检测器。光二极管阵列检测器是近十年来HPLC最重要的突破。DAD可同时接收整个光谱区的信息,在色谱峰流出同时能进行每个瞬间的动态光谱扫描并快速采集信号,经计算机处理后得到色谱- 光谱的三维图谱,信息量大大增加。一次进样可得到每个组分峰的定量、定性和纯度信息, 灵敏度亦明显提高。大部分抗生素在高于230 nm的光谱区无吸收,而在低于230 nm的紫外区许多样本基质和流动相产生干扰,需衍生化后测定,限制了紫外检测器的应用。旋光检测有以下特点:(1)选择性高,样本仅需简单提取即可; (2)灵敏度高,利用He- Ne激光作光源,灵敏度可达5～10μg水平; (3)可同时得到流出组分的比旋度,用以定性。目前,该方法已用于红霉素、庆大霉素、羧苄青霉素和吩羧青霉素残留的测定。
2. 3 高效薄层色谱(HPTLC)
HPTLC的出现使TLC进入了复兴时期,现已成为仅次于HPLC和GC的残留分析方法。HPTLC的斑点原位扫描定量、定性和高效分离材料(Φ3～10μm) 。改变了常规TLC在灵敏度和重现性方面的不足,但保持了TLC的简便、快速和样品容量大的优点,可使用正相或反相板,分辨率几乎与HPLC相当。HPTLC在兽药残留的快速筛选性检测方面应用广泛。
2. 4 超临界流体色谱( SFC)
SFC可弥补GC和HPLC的不足,但不可能取代二者。SFC最大优点是可以方便地连接各种灵敏的检测器(MS, ECD等) ,如猪组织中磺胺类药物等抗菌素残留的SFC -MS分析。
2. 5 毛细管区域电泳(CZE)
CZE是20世纪90 年代以来研究最活跃的分析技术之一。1989年开始有商品出售。CZE不同于传统的凝胶电泳技术, CZE使用直径仅25～50μm的毛细管而不用载体,待测组分在高压(20～30 kV)下泳动,截面积小,热量和泳速均匀。所以, CZE兼有高压电泳的高速、高分辨和HPLC灵活、高效的优点,柱效高达106塔板/m。向电解质中加入超临界胶束浓度的表面活性剂,如十二烷基硫酸钠( SDS) ,即为毛细管胶束电动色谱( cap illarymi - cellarelectrokineticchromatography,CMEC) ,分离范围可扩展至中性或两性分子,分离效能亦进一步提高。CZE将在简化样本前处理、多残留分析和分析自动化方面发挥重要作用。目前CZE的主要问题是样品量太小,限制了检测的灵敏度。CZE - MS可能是最好的解决办法。
2. 6 联用技术
各种分析技术联用是现代兽药残留分析乃至整个分析化学方法上的发展特点。计算机的应用加速了这一趋势。联用技术可扬长避短,一般兼分离、定量和定性(分子结构信息)于一体,因而特别适用于确证性分析。常见的联用技术,如TLC- MS、GC - MS、LC - MS、CZE - MS、LC - NMR、SFC - MS等。
TLC - MS是最简单的离线联用技术。GC - MS已相当成熟,应用相对较多。但这些联用仪价格昂贵,远不如HPLC或GC那样普及。MS无疑可作为HPLC的通用型检测器。使用微型柱(15 ×0. 3 cmid)和适宜的接口技术,如热喷雾( TSP) 、微粒束( PB)等解决了LC与MS的连接问题;使用软电离技术,如快原子轰击( FAB) 、场解吸( FD)等解决了难气化物质的离子化问题。LC - MS现在已进入实用阶段,其灵敏度较荧光检测器高1个数量级,能方便地对ng级的兽药残留组分进行检测与结构确证。
2. 7 残留分析的智能化
残留分析对象的日益复杂和样品数量的增加使分析过程对计算机的依赖愈来愈大,主要表现: (1)检索系统,如建立待测物的GC或HPLC数据库; (2)专家系统,如分析条件优化和数据处理; (3)操作过程自动化,如国外已经出现的实验室机器人。
3 免疫分析技术
免疫分析是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的新型分析技术。兽药残留免疫分析方法的建立步骤包括待测物选择、半抗原及人工抗原的合成、抗体制备和测定方法建立[ 5 ]。其质量控制原则应与常规理化分析技术一致。免疫反应具有极高的选择性和灵敏性,因此,免疫分析技术无论作为兽药残留分析的检测手段还是样本净化方法,都能使分析过程特别是前处理步骤大大简化。目前几乎所有重要的兽药已建立或试图建立免疫测定法(多数是EL ISA) [ 5 ] ,如青霉素、链霉素、四环素、氯霉素、磺胺二甲基嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶、莫能菌素、盐霉素、阿维菌素等。将免疫分析与理化分析技术联用,其中较重要的是抗体介导的净化技术,典型代表是免疫亲合色谱。将免疫亲合色谱作为理化测定技术的净化手段,可使兽药残留分析将免疫技术的高选择性和理化技术的快速分离和灵敏性融为一体。IAC - HPLC或IAC - GC是常见的联用方式,如氯霉素、乙烯雌酚、甲基睾酮/去甲睾酮、阿维菌素、依维菌素等残留的分析。
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