|
[摘 要] 利用10对微卫星标记对中国10个家驴品种的遗传结构进行了分析，计算了多态信息含量、遗传杂合度和有效等位基因数，得到了由Nei氏遗传距离和标准遗传距离为基础的NJ聚类图。结果表明:10对微卫星引物中，HTG7，HTG10，AHT4，HTG6，HMS6，HMS3 共6个位点具有高度多态性（PIC>0.5），HMS7位点具有中度多态性，其余3个微卫星座位（HMS1，HTG4和HMS5）为单态。7个多态位点在10个驴种的平均PIC、H、E分别为0.7642、0.8072、5.9911，杂合度相对较高。各驴种间遗传变异比较大，遗传距离基本与其地理分布相一致。研究结果为加强我国家驴品种种质特性研究及保护利用提供了科学的依据。
[关键词] 家驴；微卫星标记；遗传多态性
中国是世界上家畜遗传资源最丰富的国家之一，是名副其实的养驴大国。1998 年的资料显示，我国当年的养驴数量是955.8万头，约占世界养驴总数（4336.5万头）的22%，居第一位[1]。不可否认，随着全球畜牧业商品经济的发展，以及现代家畜育种理论和方法的应用，使得家畜生产性能得到前所未有的改进。但是，在取得辉煌成绩的同时，家畜遗传资源多样性也受到严重的威胁。19世纪80年代进行的畜禽品种资源普查结果表明：中国已有10个地方良种消失，8个濒临灭绝，20个数量正在减少，今天这种情况还在加剧[2]。据联合国粮食与农业组织1993年统计，大约30%的家畜品种资源处于灭绝状态。这不仅是现有资源丢失的问题，同时也是家畜育种素材的损失，可能对家畜育种带来不可预料的后果。因此保护这些家畜遗传资源不受破坏，查清楚它们之间的亲缘关系，已是一项刻不容缓的任务。
由于我国幅员辽阔，自然条件、生态环境、经济条件的差异，经过长期的自然选择和人工选择，形成各具特色的地方家驴品种，如关中驴。它们是宝贵的遗传资源财富，是进行育种改良很好的素材。而我国地方品种在分类与命名上还存在诸多问题，如同种异名、同名异种等。联合国粮农组织（FAO）在其持续发展和管理动物遗传资源的战略计划中，也将微卫星作为优先推荐的分析工具，并制定了家畜品种遗传距离的全球方案[3]。利用微卫星技术对动物遗传资源进行研究，国内外有很多的相关报道。Aranguren-Mendez 等[4]用蛋白质座位和微卫星座位分析了西班牙加泰隆驴的遗传变异。Jordana等[5]用微卫星标记分析了西班牙5个濒危驴品种的遗传多态性,表明微卫星标记可以反映驴品种遗传多样性，对制定家驴遗传资源保护计划有重要意义。在国内，吴锦淑(硕士论文,1998)对我国部分家驴的血液蛋白质座位和血清乳酸脱氢同功酶(LDH)等生化遗传标记方面做了研究，表明关中驴、晋南驴、庆阳驴、德州驴血缘关系密切，琼州驴和新疆驴血缘较近，云南驴与其它驴种遗传距离相对较远，可能在与西南周边国家的通商贸易中，受到南亚、东南亚驴种的影响，产生遗传变异。高雪等[6]研究了新疆驴、凉州驴、云南驴白蛋白、前白蛋白、后白蛋白、运铁蛋白、碱性磷酸酶、酯酶和乳酸脱氢酶6个座位的多态性，从血液蛋白水平上对我国 15 个地方驴品种进行了群体遗传分析。谢芳[7]以关中驴、晋南驴、广灵驴、德州驴和华北驴为研究对象，利用微卫星标记分析了品种内和品种间的遗传多样性。朱文进[8]等对我国8个地方驴种遗传多样性和系统发生关系的微卫星分析,结果表明,我国地方驴种基因多态性和遗传多样性相对较高,各驴种的分子系统发生关系与其育成史和地理分布基本一致。
本研究拟用10对微卫星引物对中国10个家驴品种进行微卫星多态性分析，以期丰富中国家驴品种微卫星数据库，为我国家驴遗传资源的保护与利用提供科学依据。
1材料和方法
1.1样本
根据中国家驴品种分布特点，共采集415份样品（全血），用ACD抗凝，快速取回放入-70℃保存。样品数及分布见表1，其中2个大型驴（关中驴、德州驴），3个中型驴（庆阳驴、泌阳驴、佳米驴），5个小型驴品种（滚沙驴、新疆驴、太行驴、西吉驴、蒙古驴）。
表1 10个中国家驴品种分布及样品数
|
品种 |
数量 |
采样地点 |
品种 |
数量 |
采样地点 |
|
德州驴DZ |
35 |
山东省德州市 |
太行驴TH |
38 |
河南省林州市 |
|
关中驴GZ |
39 |
陕西省扶风县 |
滚沙驴GS |
37 |
陕西榆林 |
|
庆阳驴QY |
36 |
甘肃省庆阳市 |
蒙古驴MG |
97 |
内蒙古赤峰市 |
|
佳米驴JM |
36 |
陕西省米脂县 |
新疆驴XJ |
39 |
新疆伊宁市 |
|
泌阳驴BY |
26 |
河南省泌阳县 |
西吉驴GY |
32 |
宁夏固原 |
1.2 微卫星引物
根据文献[4, 5, 9]，筛选15对特异性微卫星引物，其引物序列及反应条件见表2。
表2 微卫星引物序列及退火条件
|
微卫星位点
Microsatellite |
引物序列（5’-3’）
Primer sequence (5’-3’) |
退火温度 ℃
Annealing temperature ℃ |
|
AHT4 |
AAC CGC CTG AGC AAG GAA GT |
64.0 |
|
HTG6 |
CCT GCT TGG AGG CTG TGA TAA GAT |
60.0 |
|
HTG7 |
CCT GAA GCA GAA CAT CCC TCC TTG |
65.5 |
|
HTG10 |
CAA TTC CCG CCC CAC CCC CGG CA |
58.8 |
|
HMS3 |
CCA ACT CTT TGT CAC ATA ACA AGA |
58.0 |
|
HMS5 |
TAG TGT ATC CGT CAG AGT TCA AA |
62.0 |
|
HMS6 |
CAA GCT GCC AGT ATT CAA CCA TTG |
64.3 |
|
HMS7 |
CAG GAAACT CAT GTT GAT ACC ATC |
57.0 |
|
HMS1 |
CAT TCT TCA TGT CTG CTT GG |
56.0 |
|
HTG4 |
CTA TCT CAG TCT TGA TTG CAG GAC |
60.0 |
|
VHL20 |
CAA GTC CTC TTA CTT GAA GAC TAG |
61.0 |
|
ASB2 |
CCA TTC CCG CCC CAC CCC CGG CA |
58.0 |
|
HMS2 |
CTT GCA GTC GAA TGT GTA TTA AAT G |
57.0 |
|
HTG15 |
TCC TGA TGG CAG AGC CAG GAT TTG |
58.5 |
|
AHT5 |
ACG GAC ACA TCC CTG CCT GC |
60.0 |
1.3 PCR反应体系及反应程序
12.5 µL PCR反应体系为：10×buffer 1.5 µL(鼎国公司生产，含Mg2+)，2.5 mmol/L dNTPs 0.75 µL，10 nmol/L引物0.25 µL，0.5 U/µL Taq DNA polymerase 1 µL，100 ng/µL DNA模板1.0 µL，剩余的体积用水补足。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，X ℃ 30 s（X因座位而异），72 ℃ 45 s，36个循环；72 ℃10 min，4 ℃保存。
1.4 PCR产物的电泳检测和基因型的判定
先用1.5% 琼脂糖检测PCR扩增产物，再利用8% 的非变性聚丙烯酰胺作垂直电泳，用quantity one系统进行照相，并用该系统自带软件作微卫星等位基因大小分析，以确定基因型类型。
1.5 统计指标
通过聚类分析软件（章明，中国农科院家禽研究所），Popgene32软件计算各对微卫星基因座的等位基因频率，多态信息含量（PIC）[10]，遗传杂合度（H）和有效等位基因数（E）。
2 结果与分析
2.1 微卫星遗传变异
本试验共选取15个微卫星位点，只有10个位点扩增出良好的条带。在10个微卫星座位中，HTG7，HTG10，AHT4，HTG6, HMS6, HMS3，HMS7共7个位点具有多态性，其余3个微卫星座位（HMS1, HTG4和HMS5）为单态。7个多态位点共有80个等位基因，其中，AHT4位点的等位基因数最多，达到15个，HMS7座位则只有6个。7个具有多态微卫星基因位点的有效等位基因数（E）、多态信息含量（PIC）和杂合度（H）见表3。
2.2 群体内遗传变异
共有等位基因可能是物种基因组中最为古老、保守的等位基因，其余等位基因则是在进化过程中由于插入、缺失等突变机制造成的。10个家驴品种在7个位点上包含29个共有等位基因，详见表4。
2.3 群体间遗传变异
遗传距离是群体间遗传变异的度量，能客观的反映品种间的遗传变异与分化。通过基因频率，计算了各家驴品种间的Nei氏[11]遗传距离（DA）和标准遗传距离（DS）（见表5）。从遗传距离分析可以发现,关中驴（GZ）、佳米驴（JM）、固原驴（GY）、新疆驴（XJ）两两之间的遗传距离都很小(DA<0.11，DS<0.11）。
分别采用DA和DS两种遗传距离，通过dispan软件进行UPGMA聚类分析，结果见图1、图2。从上述聚类图中可以看出，10个品种总体聚类情况都是按照地理分布进行聚类，但在图2中聚成了2大类。在DA/UPGMA（图1）中，关中驴和佳米驴首先聚为一类，然后再与西吉驴和滚沙驴聚为一类；而在DS/UPGMA（图2）中，西吉驴和滚沙驴先聚为一类，然后再同佳米驴，关中驴聚为一类，顺序发生了变化，并且，太行驴、蒙古驴和德州驴聚为另一类。根据Bootstrap[12]抽样检验的数字来看，DA/UPGMA聚类图的可靠性比较高，因此作为本研究的首选聚类图（图1）。
表3 7对微卫星在10个驴群体中的多态信息含量(PIC)、杂合度(h)和有效等位基因数(E)
|
座位 |
遗传指标 |
DZ GY GZ GS JM BY QY TH XJ MG |
|
AHT4 |
PIC |
0.8587 |
0.8159 |
0.8784 |
0.8180 |
0.8561 |
0.8429 |
0.8792 |
0.8282 |
0.8719 |
0.8838 |
|
H |
0.8865 |
0.8488 |
0.8940 |
0.8503 |
0.9217 |
0.8768 |
0.9038 |
0.8572 |
0.8951 |
0.8983 |
|
E |
7.9288 |
6.0287 |
8.4941 |
6.1653 |
10.905 |
7.0675 |
9.0619 |
6.4899 |
8.5697 |
9.3909 |
|
HTG6 |
PIC |
0.8149 |
0.8041 |
0.8095 |
0.8246 |
0.7541 |
0.8018 |
0.7986 |
0.8490 |
0.8530 |
0.8124 |
|
H |
0.8480 |
0.8407 |
0.8422 |
0.8556 |
0.7975 |
0.8425 |
0.8323 |
0.8760 |
0.8797 |
0.8382 |
|
E |
6.0945 |
5.7692 |
5.9298 |
6.4000 |
4.6756 |
5.6882 |
5.5577 |
7.3602 |
7.5635 |
6.0125 |
|
HTG10 |
PIC |
0.8720 |
0.8525 |
0.8559 |
0.8453 |
0.7992 |
0.8075 |
0.8618 |
0.8210 |
0.8893 |
0.8756 |
|
H |
0.8957 |
0.8810 |
0.8808 |
0.8732 |
0.8336 |
0.8478 |
0.8889 |
0.8502 |
0.9104 |
0.8909 |
|
E |
8.5366 |
7.5294 |
7.6625 |
7.2000 |
5.5846 |
5.7313 |
8.0000 |
6.2108 |
9.8136 |
8.7807 |
|
HMS7 |
PIC |
0.8803 |
0.8093 |
0.8549 |
0.7530 |
0.8087 |
0.7946 |
0.8354 |
0.8186 |
0.8032 |
0.8818 |
|
H |
0.9039 |
0.8390 |
0.8807 |
0.7953 |
0.8410 |
0.8338 |
0.8652 |
0.8920 |
0.8364 |
0.8965 |
|
E |
9.1383 |
5.7143 |
7.5851 |
4.5981 |
5.7926 |
5.4256 |
6.7203 |
8.2571 |
5.6977 |
9.2305 |
|
HMS7 |
PIC |
0.4561 |
0.5061 |
0.4793 |
0.5204 |
0.4786 |
0.5604 |
0.4592 |
0.5982 |
0.4760 |
0.5370 |
|
H |
0.5503 |
0.6044 |
0.5791 |
0.6095 |
0.5545 |
0.6747 |
0.5655 |
0.6454 |
0.5536 |
0.5882 |
|
E |
2.1855 |
2.4627 |
2.3346 |
2.5068 |
2.2052 |
2.7128 |
2.2555 |
2.9518 |
2.3151 |
2.5661 |
|
HMS6 |
PIC |
0.7624 |
0.7952 |
0.6408 |
0.8124 |
0.6985 |
0.4853 |
0.4908 |
0.7680 |
0.5311 |
0.7779 |
|
H |
0.8042 |
0.8345 |
0.8740 |
0.8474 |
0.8915 |
0.9167 |
0.7665 |
0.8905 |
0.7614 |
0.8323 |
|
E |
4.8167 |
5.5728 |
3.2523 |
6.0845 |
3.8457 |
2.3607 |
2.3835 |
4.9622 |
2.5589 |
5.1636 |
|
HTG7 |
PIC |
0.8684 |
0.8409 |
0.8511 |
0.8432 |
0.8689 |
0.8884 |
0.7275 |
0.8642 |
0.7231 |
0.8084 |
|
H |
0.8928 |
0.8673 |
0.8740 |
0.8689 |
0.8915 |
0.9167 |
0.7665 |
0.8905 |
0.7614 |
0.8323 |
|
E |
8.3333 |
6.8156 |
7.2746 |
6.9865 |
8.2492 |
9.7627 |
4.0902 |
8.0756 |
4.0223 |
5.8086 |
|
平均PIC |
0.7875 |
0.7749 |
0.7671 |
0.7741 |
0.7520 |
0.7401 |
0.7218 |
0.7923 |
0.7353 |
0.7967 |
|
平均H |
0.8259 |
0.8165 |
0.8075 |
0.8143 |
0.7985 |
0.7931 |
0.7730 |
0.8351 |
0.7823 |
0.8258 |
|
平均E |
6.7191 |
5.6989 |
6.0761 |
5.7059 |
5.8941 |
5.5498 |
5.4384 |
6.3297 |
5.7915 |
6.7076 |
表4 10个驴品种在7个微卫星座位上的共有等位基因频率
|
|
AHT4 |
HTG6 |
HTG10 |
HMS3 |
HMS7 |
HMS6 |
HTG7 |
|
共有等位基因(bp) |
155 |
87 |
104 |
161 |
108 |
165 |
138 |
|
157 |
89 |
106 |
165 |
119 |
167 |
146 |
|
159 |
91 |
114 |
167 |
121 |
175 |
150 |
|
|
93 |
116 |
169 |
|
177 |
152 |
|
|
97 |
|
|
|
|
|
3 讨论
3.1 群体遗传多样性分析
本研究中，10对微卫星引物PCR扩增取得了良好的效果，但聚丙烯电泳后分析发现，只有HTG7，HTG10，AHT4，HTG6, HMS6, HMS3 这6个位点具有高度多态性（PIC>0.5），HMS5位点具有中度多态性，其余3个微卫星座位（HMS1, HTG4和HMS7）为单态。7个多态位点在10个驴种的平均PIC、H、E分别为0.7642、0.8072、5.9911，杂合度相对较高。其中蒙古驴、泌阳驴中有个别个体在HMS5位点出现变异。Aranguren-Mendez J等[9]研究表明，HTG4，HMS7在5个濒危西班牙驴品种中的PIC分别为0.40，0.53，而本研究中这两个位点无多态；但HMS1位点结论一致，都无多态；其他7个多态位点在中国家驴中相对应的PIC比西班牙驴都要高，说明中国家驴在这7个位点多态性丰富。10个家驴品种的平均杂合度为0.8072，说明中国家驴遗传资源丰富，且变异范围很大。
表5 10个品种间Nei’s遗传距离（DA，对角线下方）和Nei’s标准遗传距离（DS，对角线上方）
|
|
DZ |
GY |
GZ |
GS |
JM |
BY |
QY |
TH |
XJ |
MG |
|
DZ |
|
0.1812 |
0.0675 |
0.1641 |
0.1091 |
0.1031 |
0.1806 |
0.1062 |
0.1587 |
0.1064 |
|
GY |
0.1778 |
|
0.0492 |
0.0246 |
0.1113 |
0.1085 |
0.0767 |
0.1396 |
0.0859 |
0.1067 |
|
GZ |
0.1021 |
0.0734 |
|
0.0725 |
0.0493 |
0.0179 |
0.0375 |
0.0967 |
0.0270 |
0.1299 |
|
GS |
0.1621 |
0.1002 |
0.1025 |
|
0.0968 |
0.0988 |
0.1127 |
0.1717 |
0.0903 |
0.1145 |
|
JM |
0.1312 |
0.0966 |
0.0641 |
0.1069 |
|
0.1397 |
0.1125 |
0.2080 |
0.0909 |
0.1492 |
|
BY |
0.1373 |
0.1466 |
0.0894 |
0.1325 |
0.1425 |
|
0.0536 |
0.1349 |
0.0577 |
0.1336 |
|
QY |
0.2004 |
0.1180 |
0.1033 |
0.1603 |
0.1437 |
0.1209 |
|
0.1637 |
0.0013 |
0.1269 |
|
TH |
0.1439 |
0.1405 |
0.1236 |
0.1715 |
0.1491 |
0.1693 |
0.1591 |
|
0.1720 |
0.1611 |
|
XJ |
0.1679 |
0.1118 |
0.0836 |
0.1171 |
0.1140 |
0.1202 |
0.0609 |
0.1589 |
|
0.1428 |
|
MG |
0.1068 |
0.1222 |
0.1102 |
0.1208 |
0.1173 |
0.1144 |
0.1209 |
0.1334 |
0.1078 |
|
图1 根据DA距离构建的10个驴品种的系统发生树
图2 根据DA距离构建的10个驴品种的NJ树
3.2 群体间遗传变异
据考证，中国的驴最早源于古代新疆一带的小毛驴，之后向北、向东进入内地[13]。沿着黄河流域分布到甘肃、陕西、河南、河北和山东等省形成著名的关中驴、佳米驴、庆阳驴、德州驴[14]。由DA/UPGMA（图1）可以看出，聚类结果与其地理分布和育成史基本吻合。新疆驴，庆阳驴，固原驴和关中驴这四个品种遗传距离最近，而且聚类关系也非常紧密，说明它们有很近的亲缘关系，印证中国驴源于古代新疆一带的说法。
德州驴产于山东惠民和德州两地，以无棣县质量为佳，是我国著名的大型驴种，役用和食用性能良好。蒙古驴的数量不多，但分布范围较广。内蒙古见于乌兰察布盟由达尔罕茂明安联合旗向西沿中蒙边境一带；甘肃祁连山、马鬃山和阿克塞等地；新疆比较集中的分布区位于准噶尔盆地东部的卡拉美里山至乌伦古河一带。从地理位置看，二者相距比较远，但是2个聚类图都把它们聚为一类。可能原因是由于德州驴优良的生产性能，被引入改良蒙古驴，导致部分血缘渗入。
3.3总群体杂合度、亚群杂合度和遗传分化系数
总群体杂合度（HT），亚群体内杂合度（HS）及遗传分化系数（GST）由dispan软件计算得到。总群体是将所研究的所有群体视为一个群体，亚群杂合度是各群体的平均杂和度，遗传分化系数是指基因分化的程度。Nei在他的基因多样性分析中认为[15]：组成一个“种”的所有种群的总遗传多样度（HT）包括各种群内的遗传多样性（HS）和各种群间的遗传多样性（Dst）,即：HT＝HS+ Dst。
导致群体间分化的遗传分化变异系数GST（GST＝1- HS/ HT）的值变化从1～0。当各群体的所有等位基因频率几乎相同时，GST的值接近0，各群体间几乎没有分化；当各群体内的遗传多样性在HT中所占比例减小，群体间的遗传分化增大时，说明总遗传多样性几乎存在于各群体之间，GST的值接近1。从表6可以看出：HMS6、HTG7两个位点的GST估算值较大，分别为0.049587、0.040570，这意味着这2个位点在不同品种间的基因分化占总群杂和度的4.959％、4.057％；大部分位点GST值在0.3左右，相对比较高，这说明品种间遗传变异比较大。
表6 7个微卫星位点的遗传分化系数
|
位点Loci |
GST |
HT |
HS |
|
AHT4 |
0.0287 |
0.8965 |
0.8707 |
|
HTG6 |
0.0310 |
0.8600 |
0.8334 |
|
HTG10 |
0.0304 |
0.8899 |
0.8628 |
|
HMS3 |
0.0390 |
0.8799 |
0.8456 |
|
HMS7 |
0.0154 |
0.5975 |
0.5883 |
|
HMS6 |
0.0496 |
0.7630 |
0.7252 |
|
HTG7 |
0.0406 |
0.8797 |
0.8440 |
|
All loci |
0.0341 |
0.8238 |
0.7957 |
参考文献
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