布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)是由细胞内寄生的布鲁氏菌引起的一种危害非常严重的人畜共患传染病。近年来,我国布病流行呈上升趋势,由于养殖基数大,阳性动物比例高,扑杀成本负担重,因此,在2014年农业部组织制定的《常见动物疫病免疫推荐方案(试行)》中,首次允许对奶畜进行布病的免疫。本文详细分析了近年来布病在我国人畜间的流行现状,总结了当前布病分型与诊断技术以及群体监测和个体现场快速筛查方法,特别是在鉴别诊断方面进行的探索性研究,最后对我国布病防控提出了建议。
1 布病的危害及其流行现状
1.1 布病的危害
布病是目前世界上流行最广,危害最严重的人畜共患传染病之一。健康动物主要通过接触病畜的分泌物、流产胎儿等感染,家畜感染后对繁殖和生产性能造成严重危害,头胎流产率高达50% ~ 80%,导致奶和肉减产约15% ~ 20%。人主要通过接触感染动物、食用污染的动物产品如奶、奶酪和肉而感染。人感染后一般持续数周或数月,如果不及时治疗,则转为慢性病,中壮年患者丧失劳动能力、妇女流产、男性睾丸炎甚至失去生育能力,同时,可引起全身多系统损害和出现并发症,如肝脾肿大、关节炎、脑膜炎、心内膜炎等。据报道,对1500个布病患者的临床表现进行统计分析,发现多达34种临床症状。
1.2 近年来我国布病的流行现状
1949年以前,我国人畜间布病流行情况没有准确的数据。在1950 ~ 1970年我国人畜中布病流行处于高发期,部分省份疫情严重,1980 — 1990年疫情基本得到控制,2000年以来,我国疫情又迅速反弹,目前布病防控形势异常严峻。
动物的流行
根据兽医公报数据进行的流行病学分析
根据我国兽医公报报告的数据,2004年到2015年期间,我国家畜布病发病数最多年份的是2011年,发病125030例(图1);年发病次数最多的是2012年,发病28958次;发病省份最多的年份是2015年,23个省份发病(图2)。统计发现,发病家畜主要以绵羊和牛为主,2012年和2013年只有绵羊发病的病例报告,2006年以后无山羊病例报告(表1)。
2010年至2015年间,每年的4 ~ 10月份为家畜布病高发时期(图3),这与牛羊的繁殖期相吻合。近三年来,我国家畜布病发病数排在前列的省份为内蒙古、新疆、陕西、山西、湖北、山东、黑龙江、贵州、浙江等。内蒙古自治区2011年发病数为117623例,占到全国动物发病总数的94.08%,是我国最为严重的地区。
动物的流行
根据文献报道的流行情况进行的分析
我国文献报道的动物布病流行病学数据显示,阳性率在不同地区、不同养殖场差异较大,这可能与样本采集、养殖场的管理及布病综合防控重视程度有关。牛羊在一些地区布病感染严重,猪的布病报道较少,我国部分野生动物如秦岭山脉的羚牛、新疆天山马鹿、喜玛拉雅旱獭也报道存在布鲁氏菌的感染。
尽管兽医公报和文献报道的我国动物布病流行数据存在差异,但有一点是明确的,即目前我国布病流行严重,防控形势严峻。近年来,主要以牛和羊感染为主,在北方牛羊养殖区个别畜群流行较为严重,其他地区有散发的现象,可能与牛羊调运有关。有关犬布鲁氏菌的分离以及引起布病病例、种公牛与种公羊以及野生动物存在布病流行的现象,提示我们应该加强监管力度,加大检疫范围,为布病防控获得更加详实准确的流行病学数据。
人布鲁氏菌病发病情况
发病趋势
根据国家卫计委公布的数据,我国1975年前后人的布病处于高发期,80年代到90年代初处于平稳期。从2000年到2015年,我国人间布病发病数处于显著增长期(图4)。在37种法定报告传染病中,布病发病人数由2002年的17位升至2013年的第6位。2014年全国报告布病发病人数为57222例,年发病率为4.18/10万,发病人数和年发病率均处于历史最高。目前几乎全国31个省份均有人感染布病的报道,其中内蒙古自治区为高发省份之一,年发病病例占到全国总数的40%。
人布鲁氏菌病发病情况
发病新特点
我国发病人群中,男性高于女性,兽医、养殖与屠宰人员、布病研究人员等相关职业人群显著高于其他人。在流行区域上,牧区高于非牧区,农村高于城市。发病高峰期一般在每年的4 ~ 8月份,目前疫情发展到由农村向城镇逼近和蔓延的特点。我国人感染布病主要是通过接触患病的家畜,也可通过剥羊皮、剪羊毛、切病畜肉等感染;进食染菌的生乳、乳制品、未煮熟的病畜肉类也可导致布鲁氏菌经消化道进人体内,也有屠宰场工人、防疫员、实验室或医院工作人员通过吸入布鲁氏菌气溶胶而发生感染的报道,相关职业人群应该加强防护。
2 布鲁氏菌的分子分型与诊断技术研究进展
2.1 我国布鲁氏菌主要流行菌种和生物型
目前我国布病的流行特点是存在多种型并存和跨种间感染现象,已分离到除猪种布鲁氏菌生物2、4、5型以外的6个经典布鲁氏菌种的其他15个生物型。根据分离鉴定结果,我国人群布病感染有85%是由山羊布鲁氏菌感染引起。家畜中分析发现羊种布鲁氏菌1型和3型、牛种布鲁氏菌1型和3型是我国分离的主要流行株,猪种布鲁氏菌很少分离到。
2.2 布鲁氏菌的分子分型技术
PCR-RFLP技术
PCR-RFLP技术是采用PCR扩增布鲁氏菌种属特异性或种株间多态性基因DNA片段,然后运用限制性内切酶酶切PCR产物,对产物进行电泳,通过电泳后出现的片段差异性来区分不用来源的基因组序列的多态性。陈伟业等以布鲁氏菌IS711和omp2基因具有的种属特异性,实现了M5疫苗与羊种强毒株16M的鉴别,该技术只能对个别菌株间存在内切酶位点差异的菌株进行分型鉴别。
MLVA技术
MLVA技术是一种根据散在于菌株基因组中不同独立位点可变数目串联重复序列(VNTR)的拷贝数多少来进行基因分型的方法。我国学者对17株猪种布鲁氏菌生物1型菌株和疫苗株S2进行了基因组的比较分型,结果表明,通过该方法可将S2与其它基因群、基因型的分离株进行区分。
2.3 疫苗免疫与自然感染鉴别诊断技术
布鲁氏菌的诊断技术主要有细菌的分离鉴定、分子生物学方法和血清学方法。分子生物学方法主要包括常规PCR、实时定量PCR、核酸探针与分子斑点杂交技术等,根据基因组差异可以实现不同布鲁氏菌种间的鉴别,由于疫苗株与自然感染同种野毒株在基因组序列差异性上不具有广泛性,目前很难通过分子生物学方法进行种内菌株的鉴别诊断。血清方法主要有RBPT、试管凝集试验(SAT)、cELISA、免疫偏振光技术等。由于RBPT和SAT等传统的抗体检测技术不能进行疫苗免疫与野毒感染的鉴别诊断,这里主要对cELISA和免疫偏振光技术在鉴别诊断方面的应用进行了介绍。
分子生物学鉴别诊断技术
PCR技术
根据疫苗株与野毒株基因组序列上的差异DNA序列设计引物,应用PCR技术对其进行鉴别诊断。Nan等根据猪种布鲁菌疫苗株S2基因序列在IclR基因上存在25 bp序列缺失,以该特征性缺失片段设计特异性引物,同时通过多对引物,即结合经典的AMOS-PCR方法中猪种1型特异性检测引物,建立了鉴别猪种布鲁氏菌S2疫苗株和猪种布鲁菌1型菌株的双重PCR检测方法。
分子生物学鉴别诊断技术
荧光探针实时定量PCR
依据布鲁氏菌基因组DNA的单核苷酸多态性(SNP)设计荧光探针,建立鉴别相关菌株的Real-time PCR技术。布鲁氏菌疫苗株基因组上的SNP位点在其同一布鲁氏菌种上是否具有普遍性是鉴别诊断的分子基础。谭鹏飞根据牛种布鲁菌疫苗株A19上ClpX基因的SNP位点设计引物和Cycling探针,建立了鉴别疫苗株A19与其它布鲁氏菌的Real-time PCR方法。
分子生物学鉴别诊断技术
核酸探针与分子斑点杂交技术
根据布鲁氏菌疫苗株与其他菌株基因组DNA差异序列设计探针,通过PCR扩增差异片段,将其纯化、变性后建立斑点杂交方法可进行鉴别诊断。张岩等也在布鲁氏菌疫苗株S2的IclR基因缺失位点处设计核酸探针,建立鉴别布鲁菌S2疫苗株与其他菌株的斑点杂交法,该方法最低可以检测到10 pg DNA,能够在10 h内鉴别出布鲁菌S2疫苗株。
免疫学鉴别诊断技术
竞争酶联免疫吸附试验(c-ELISA)
针对布鲁氏菌O-多糖抗原的单克隆抗体建立的cELISA方法比iELISA具有更高的特异性,但是敏感性不如iELISA,由于单克隆抗体比引起交叉反应的非特异性抗体具有更高的亲和力,所以cELISA可以消除耶尔森菌O:9、大肠杆菌O:157等细菌的非特异性反应,而且cELISA方法降低了与疫苗株产生的残余抗体的大部分反应,可以进行鉴别诊断。
免疫学鉴别诊断技术
荧光偏振实验
荧光偏振实验(FPA)已经用于北美和欧洲的布病根除计划,是OIE规定的“贸易适用”方法,由于依赖于荧光偏振仪,我国目前很少使用FPA方法进行临床样本的检测。Gall等研究表明,FPA比cELISA更为敏感特异,通过建立合适的cut-off值,FPA可以实现S19疫苗免疫血清的鉴别。
2.4 布鲁氏菌病预报预警监测技术
奶样PCR技术
感染布鲁氏菌的动物急性期结束后,可能很少存在或无临床症状,但是80%感染的动物布鲁氏菌将长期地寄生于乳腺淋巴结和乳腺组织中,这样它们的乳汁中将持续分泌布鲁氏菌。奶样容易收集,对动物不产生任何损伤,应激几乎为零,是产奶动物布病检测的最佳样品之一。奶业发达国家要求每年对一个奶牛群的混装奶样抽检3次,如果出现阳性反应,表明群体感染,应对全群牛只筛查阳性感染牛。
环境气溶胶监测技术
据统计,全球病原微生物至少有100多种可以通过气溶胶传播,每年因微生物气溶胶引起的呼吸道感染发生率高达20%。利用微生物采样器配合PCR方法对空气中的微生物进行检测以达到监测环境微生物的目的。布病阳性动物通过向环境排菌而在空气中形成布鲁氏菌气溶胶,其他动物和人可以通过呼吸道吸入、口腔吞咽或者通过伤口和粘膜感染。本团队已建立了布鲁氏菌气溶胶荧光定量PCR检测方法,通过监测养殖场环境中布鲁氏菌气溶胶的含量、分布规律而动态监测养殖场动物群中布病的发生风险,为其防控提供支撑。
2.5 布鲁氏菌的现场快速诊断技术
环介导等温扩增技术
环介导等温扩增(LAMP)是2000年新出现的一种核酸等温扩增技术,利用具有链置换DNA聚合酶,在60℃~65℃,几十分钟即可快速完成核酸的指数级扩增,操作简单、快速,适用于基层和现场的快速检测。Ohtsuki等首次根据布鲁氏菌BCSP31基因序列设计6条引物,建立了最低可检测10 fg布鲁氏菌基因组DNA的LAMP方法。我国也于2011年以羟基萘芬蓝为指示剂建立了布鲁氏菌LAMP检测技术,表明LAMP的敏感性高于B4/B5-PCR方法。目前LAMP诊断技术仍然存在一些不足,如需要4条引物,并且引物设计复杂,对浊度的观察或加入荧光染料依靠肉眼判定结果。
重组酶聚合酶扩增技术
重组酶聚合酶扩增(RPA)技术是2006年出现的一种新的体外恒等温核酸扩增技术。应用三种酶的混合物,即能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶,在38℃左右,10 min之内获得可检出水平的扩增产物。RPA检测的灵敏度很高,能够将痕量级的核酸(尤其是DNA)模板扩增到可以检出的水平,特别适用于基层与疾病现场的检测。目前,RPA反应可以通过琼脂糖凝胶电泳,荧光扩增曲线和侧流层析试纸条(LFD)3种不同方式检测结果,凝胶电泳和荧光扩增曲线法仍然依赖实验室和荧光检测器,而LFD是一种无需特殊仪器可用于现场的方法。本团队已经根据布鲁氏菌保守的VirB基因和A19疫苗株差异位点设计RPA-nfo引物与探针,率先建立了布鲁氏菌通用型与A19疫苗株鉴别诊断RPA-LFD方法。
3 我国布病防控建议与展望
3.1 完善并推广群体监测及鉴别诊断技术,为布病防控提供支撑针对我国人畜间布病流行上升的趋势,通过群体监测发现阳性畜群,再利用鉴别诊断技术筛查并淘汰阳性动物。建议我国规模化奶牛场定期对牛场环境气溶胶和大罐奶进行布鲁氏菌病原学监测,及时评估卫生消毒和生物安全水平,科学防控。
3.2 规范和完善免疫规程,减少人为因素干扰,保障净化措施的实施按照2014年农业部组织制定的《常见动物疫病免疫推荐方案(试行)》和农业部办公厅关于印发《牛羊常见疫病防控技术指导意见(试行)》的通知,制订布病免疫规程,对免疫范围、使用疫苗种类、接种要求、免疫程序等进行科学评估,免疫后如何进行免疫效果监测,在疫苗免疫保护期内免疫水平低时是否进行补免等,逐步规范和完善。
3.3 加强检疫监管与动物扑杀补贴力度,保障现有防控规程落实到位对跨省调运的布病易感动物严格进行风险评估并按规定程序申报、审批,经检疫合格后方可调运,同时加强监管。动物卫生监督检查站要严格按规定查证验物,合法调入的动物要按规定隔离期满后方可混群饲养。加强牛羊交易市场和屠宰场所的监管,防止疫病传播。国家和地方政府根据家畜市场价格,加大扑杀动物的财政补贴力度,鼓励牛羊养殖场主动开展疫病净化工作。
3.4 加大基因缺失疫苗的研制力度,为免疫防制与净化根除相结合的防控策略提供物质支撑在保证疫苗菌株免疫效果好、安全性高、具有毒力低等优势的前提下,对现有减毒活疫苗株进行比较筛选,运用基因工程技术对菌株进行改造,缺失与布鲁氏菌毒力相关的基因,研制基因缺失疫苗,加强鉴别诊断技术研究与推广应用,为我国疫苗免疫群体中布病阳性动物的净化提供技术支撑。
|