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浅谈猪病毒性疾病的实验室检测
现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2017/1/11 12:44:32 关注：355 评论： 我要投稿
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猪场养殖管理是由若干环节组成的，实验室检测是其中重要的一环。实验室检测提供的准确、及时的信息，可用于猪场种猪的筛选、疫苗防控的评估及控制疾病的传播等方面。但在实际工作中部分养猪从业者对实验室检测还存在误区或缺乏了解，撰写本文的目的即与生猪养殖产业的同行交流一些检测心得体会，其中部分观点可能有偏颇，还请各位海涵雅正。
实验室检测的价值
——评估风险，指导防疫，种猪源头净化，控制疾病传播
猪的密集饲养、较为封闭的差环境导致疾病易发生、易扩散，因此规模化猪场首要的任务就是减少疾病的发病概率降低其传播的风险。疾病的发病一般存在小规模感染期，传播期和集中爆发期和耐过散毒期等几个阶段。在感染和传播期小部分发病很难被察觉或被重视，当疾病感染至大群就很难控制了。此外疫苗免疫的主要目的就是为了预防疾病，但疫苗免疫后的效果存在很多不确定因素也不容易凭经验评价，目前实验室检测普遍被应用的即是疾病的确诊和疫苗效果的评估，具体表现在：
1、疫苗免疫程序的评估
免疫程序的优劣受诸多因素影响，不恰当的免疫不仅不能发挥疫苗的功效，反而会引起副反应。如母源抗体干扰（本质上讲活苗也是病毒，母源抗体较高且疫苗抗原量不足时只能消耗被动免疫，导致免疫失败和造成较长的无保护期）、不同疫苗间的干扰等等，实验室检测可评估猪场的免疫程序是否合理，及时作出调整。
2、疾病的确诊与对症下药
临床上由单一病原引起的发病比例越来越少，大多数为混感，这增大通过临床剖检判断疾病的难度，误诊后患无穷（如06年的高热病爆发早期被判断病原为猪瘟，南辕北辙）。有些病原如圆环、蓝耳等，其致病机理类似于人类的艾滋病，主要引起的是猪机体的免疫抑制，继发其他疾病的症状，如根据临床症状治疗往往治标不治本。实验室检测的一个重大价值即诊断出幕后黑手，釜底抽薪对症下药。
3、后备猪群的选育及种猪的淘汰
猪场的绝大多数问题的根源来自于种猪，因此通过对种猪的定期检测可将先天带毒和散毒的种猪甄别，重点防控或淘汰，减少疾病传播、降低弱仔率并降低饲养这些不合格种猪的饲养成本。
4、疾病传播的早期干预
疾病的发生和传播是有规律的，早期星星之火，后期熊熊烈火。疾病如感染至大群即使采取正确的措施，也是杀敌一千自损八百。因此早诊断，早干预，及时紧急免疫（部分疫苗紧急接种效果良好）或采取隔离措施可将风险消灭于萌芽状态，确保大群的稳定。
5、建立合理的用苗和用药依据
长期地用药和用某些疫苗对猪机体未必有益，通过检测确定用药期或停苗期（或降低免疫频次）对于保持猪群整体的健康利远大于弊。此外通过检测综合本厂情况，确定猪场的用苗的剂量及种类（需根据猪场的感染情况及疾病的传播特性和致病力等特征制定）也具有参考价值的。例如有的规模化猪场蓝耳疫苗使用量仅为0.1头份，其用量是检测评估后的结果。
检测通用的方法及适用范围----不同方法有优劣，选用需慎重，否则劳民伤财，作为兽医或养殖场厂长，对检测方法可以不精但不能不懂，似懂非懂容易产生思维误区，检测白花了钱，没解决问题，还可能产生误导。下面就几种常用的检测方法的优缺点向大家做一介绍。
1、酶联免疫吸附试验（ELISA）
优点：操作简单，省时快捷，可同时检测多个样本，普通猪场或兽医站即可考虑配置，对人员素质要求不高。
缺点：大部分试剂盒不能区分野毒和疫苗毒；其抗体滴度与具有保护性的中和抗体滴度无绝对线性关系，在蓝耳抗体检测尤为明显（也就是说检出的抗体滴度其实是杂抗体的滴度，意味着抗体滴度高，保护力未必高，这只能作为疫苗免疫后产生免疫力的依据或感染发生的依据）。
（1）ELSIA的适用范围
① 稳定场的免疫程序评价
如首免日龄的确定，通过抗体检测可确定母源抗体是否存在干扰及最佳的免疫日龄（本质上疫苗也是弱毒，会消耗母源抗体，如母源抗体过高将完全中和疫苗毒，则不仅未产生免疫反而降低了母源抗体保护）。
② 检测疾病的感染率
仅适用于未做某种疫苗的疾病的感染状态评估（伪狂犬除外）。如猪场未做蓝耳疫苗免疫，可通过检测不同日龄段的仔猪的蓝耳抗体阳性率，确定猪场是否存在蓝耳病毒的水平传播。
③ 不稳定场通过检测抗体判断是否发病
是可以通过离散度和抗体滴度判定的，但这需要较多的实践经验和针对本场的大量的样本分析，一般花费极高。由于病原感染和疫苗免疫均可以产生抗体，因此当疫情来临时，通过ELISA不能判定哪些抗体是疫苗产生的，哪些是病原产生的，因此必需结合病原检测（PCR）结果才能确诊。在此声明不推崇通过ELISA检测的数值高低就判断猪群是否爆发疾病，特别是样本数量较少时随机性太大。
（2）ELISA检测的误区和建议
① 抗体检测需要足够的样本数
一般母猪群样本数至少10%，才能反映总体的情况，样本数过少，随机性太大，容易误读。
② 样本应具有代表性，采样应参照免疫程序
如伪狂犬采样，可按照母猪胎次及仔猪日龄段采样，采样的仔猪日龄应参考猪场的免疫程序及疫苗免疫持续期规律，通过对这些数据的分析能判断猪场是否存在病毒的水平或垂直传播，及感染的起始时间，这些数据对免疫程序调整非常具有价值。
③ 周期性的抗体检测数据更有价值
抗体检测应具有周期性，最好每季度检测一次。通过对比近期数据与前几年同时期的数据，对于猪场的科学决策具有参考价值。
2、聚合酶链式反应（PCR或RT-PCR）及基因序列测定
PCR检测针对的是病原，更具有针对性，是确诊的重要依据。基因测序可确定猪场内病毒流行情况（毒株种类和比例），基因测序的前提是进行PCR检测。但PCR操作有难度，对人员素质和实验条件要求高，此外有时需采用多种方法确诊，因此做PCR必需还有责任心，大型规模化场从数据真实准确的角度上考虑也需要考虑配置，如不能配置也需要有可靠的合作单位。
（1）优点：针对性强、可确诊；可区分野毒与疫苗毒；q-PCR可确定病毒载量，确定发病的主因。
缺点：操作复杂，需专业人员操作；要求较高，专业人员需要有深厚的分子生物学基础，了解病原的基因结构，此外还需要有方法的支持（针对不同病原，不同基因型的多套可靠的引物序列）。
（2）PCR及测序适用范围
① 疾病诊断，确定多种病原，适用于分析发病的主因。
② 通过测序可确定病原基因型，便于对症用苗；对蓝耳的免疫尤为重要（不同毒株的蓝耳交叉保护力差）。
（3）注意事项
① 不稳定场首先应考虑采用PCR检测病料。
② PCR检测应保证病料的新鲜，路途较远时需冷冻后送检。
③ 检测时避免污染，实验室中应有相应的设施确保不出现气溶胶污染。
（4）重点病料
① 脐带血：脐带血检测用于分析母猪流产原因（脐带血还可用于检测是否为霉菌毒素或药残引起的流产）。
② 胎衣及死胎：用于分离病原或检测流产原因。
③ 精液：肌注的疫苗对公猪通过精液传播病毒防控效果不佳（其感染及传播途径均通过黏膜系统，疫苗产生的体液及细胞免疫对黏膜免疫系统作用极小），因此检测精液对预防蓝耳和伪狂犬在配种时感染母猪非常重要，但容易被忽视。
④ 血液：PCR检测血液中的病原时，需注意有些病毒如伪狂犬、猪瘟等病毒血症持续期极短，因此需要适当扩大样本容量，必要时为节约人力及检测成本，可以将三份血清合成一份检测。
⑤ 扁桃体：扁桃体是重要的免疫器官，大多数病毒首先在扁桃体中定植。通过活体采样扁桃体检测，对确定隐性感染及持续感染终止期的检出率远高于血清样品。尤其在确定蓝耳的感染持续期，种猪的猪瘟带毒方面表现显著。
⑥ 特定病原选取合适的病料：病原在不同组织中的分布不同，如猪瘟主要检测肝、脾、肾；蓝耳主要检测肺脏；伪狂犬检测脑和肺脏；圆环检测肾和脾及淋巴结；流行性腹泻检测小肠道。
3、细胞相关试验
体外培养的细胞可以模拟动物试验体内的结果，也可用于活毒的扩繁、毒价的测定等工作，是未来发展的方向。目前在几个大集团均有此设施，但该实验室对洁净程度和操作人员素质要求特别高，需要生物安全柜和相应的细胞室，可以完成以下几方面工作。
（1）病毒分离鉴定
分离纯化病毒，便于进一步分析病毒的致病性。
（2）交叉中和试验
利用分离的毒株进行交叉中和试验，可更科学地判断疫苗免疫的中和抗体对猪场分离株的中和效果，其评估的结果优于基因测序比对。
（3）血清驯化
比在活体动物上繁殖病毒安全性更高，更稳定。
（4）毒价测定
可用于测定疫苗毒价或“返饲”材料的毒价；如流行性腹泻“返饲”成功要素有以下两要点：
① “返饲”材料纯净，无PCV2和PRV等病原。
② 毒价确定，“返饲”的病毒量需要滴定，否则母猪返饲后有散毒风险；而这些问题可通过PCR及细胞相关试验解决。
重点监测的种群及监测时间
1、生产母猪群
（1）母猪群健康关系仔猪保育期间的成活率
猪场疾病的根源来自于种猪，种猪带毒、散毒是保育期仔猪难养的根源。母猪传毒可通过两个途径：
① 胎盘的垂直传播：垂直传播后即使不引起流产，也将引起产死胎或弱胎。此外如果病原在妊娠后期感染胎儿，其免疫系统将会把病原识别为自身的物质（免疫耐受性），仔猪出生后即使免疫疫苗也不会产生良好的免疫应答；并且病毒可以宿主机体作为生物反应器，成为猪场病毒传播新的来源。
② 通过排泄物或奶水的水平传播：如流行性腹泻病毒大多是由母猪通过接触传染仔猪的，因此做好母猪的监测，可提高仔猪保育期间的成活率。
（2）适宜母猪群检测的项目及时间
母猪的检测应选择母猪的特殊敏感期，在此阶段母猪免疫机能下降，容易发病或向外散毒，适宜检测的时间及项目如下：
① 防控流行性腹泻于产前15-20天可采集奶水或肛门处的粪便，通过PCR和接种细胞检测病原，如果为阳性，可做紧急隔离、疫苗接种或返饲。
② 配种前后重点检测伪狂犬病毒，配种前后伪狂犬病毒感染可影响胚胎着床，通过抗体检测可确定配种前是否需要加强免疫伪狂犬疫苗；
③ 种猪净化：空怀期活体采集扁桃体，检测猪瘟、伪狂犬和蓝耳病原，淘汰带毒种猪，这对于温和性猪瘟的净化尤其重要（我国的种猪的猪瘟带毒率为8~10%，导致猪场蓝耳爆发时形成免疫抑制往往表现为混感猪瘟）。
④ 流产母猪管理：发生流产的母猪检测脐带血，如果确定为病毒性疾病导致的流产，建议短期内禁止配种。隔离至少三个月后再次检测病原，检测合格方可使用。
2、公猪群
（1）公猪关系生产安全
公猪主要提供优质精液，精液质量影响生产成绩。试验已经证实，部分病毒感染公猪精囊后可导致精液质量下降，如伪狂犬、圆环和蓝耳等。此外公猪精液带毒的还可在配种过程中感染母猪，这在伪狂犬的疾病传播途径中表现的尤为显著，因此需关注公猪精液检测，检测方法多用PCR。
（2）公猪的检测时间
公猪应定期检测，最好每季度检测一次精液和血清。精液除常规镜检外，还需进行病原检测，如检测出蓝耳，则该公猪三个月内禁止采精；如精液中检测出伪狂犬病毒，则需坚决淘汰。公猪的伪狂犬检测应配合血清学检测，如血清学检测阳性，但精液病原为阴性，则此公猪需隔离饲养，加大伪狂犬疫苗免疫频次，预防病原向精囊传播，但其精液仍可用，不必淘汰该公猪。
3、后备种猪群
后备猪群的筛选需将抗体和抗原检测相结合，但筛选的时间需要做考量，考量标准参照病原的免疫持续期规律。如伪狂犬的母源抗体的持续期可达27个周，在伪狂犬阳性场（但生产基本稳定）的采血时间需要在27周后（因为如果没有病原中和母源抗体，其母源抗体将持续至27周，因此筛选时应注意区别对待）。其他病毒性疾病也有类似的考量，如蓝耳的持续感染期时间较长，病毒血症期易反复，这些因素均需考虑在内。
4、新引进种群
新引进的种群是猪场引进外来病毒的重要途径，新引进的种群的免疫程序与猪场现阶段的免疫程序存在差异（至少存在疫苗产商的差异），所以有可能新引进的种群在原有的免疫程序下可保护猪群不发病，不散毒，但换用猪场的免疫程序后难以防控。因此对于新引进种群需做好以下工作：
（1）严格的隔离，至少隔离三个月以上；
（2）换用猪场的免疫程序后进行评价，评价合格后才可配种；
（3）在1年内禁止混群，直到通过检测确定不散毒才可以考虑混群饲养。
5、保育群
保育期仔猪抵抗力差，是疾病感染高发期，所以在不稳定场不建议检测抗体。建议可以剖杀几头发病猪采集病料检测（即使是大群症状轻微的不引起死亡的现象，为找到致病原因也建议剖杀检测，因为病料的检出率远高于血清），提高检出效率。
稳定场保育期间大多数疫苗免疫期已超过一个月，建议在此期间检测抗体，评价免疫程序，关键评价母源抗体是否产生了干扰，从而调整部分疫苗的免疫程序。
6、育肥猪群
育肥猪群是容易被忽视的猪群，此阶段猪的抵抗力强，疾病感染后往往不表现出非常严重的症状，但会影响饲料报酬。举例说明，伪狂犬对育肥猪的危害主要在呼吸道疾病，导致咳喘，如有类似症状建议在咳喘后5天左右采血检测，如果检出病原为伪狂犬，建议在90-120日龄加强免疫一次，其产生的价值是比未做处理的育肥猪可提前至少五天出栏，经济效益远高于疫苗免疫成本。
总结
实验室检测不能解决猪场所有的问题，但确实可以解决一部分猪场迫在眉睫的问题。检测成本是猪场运营中最少的支出，不重视检测，不注意预防，造成的损失可能是难以估量的。从长远看，规模化场特别是集团需建立自己的检测实验室或依托可靠的合作单位，如果采取临时抱佛脚式的检测，会产生很多时间和信任成本。据了解在部分大型的养殖集团已经具备了相应的检测机构，可完成病原检测、抗体监测及病毒致病力分析相关的试验，因此这些养殖集团相对而言可避免走很多弯路。
总之，在规模化密集养殖条件下，养殖企业养殖管理的关键就是预防疾病，因此更应重视检测，因为检测真的不像我们想象的那么简单，在我看来检测可以贯穿于整个生产过程中的疫病防控，但大多数猪场使用或了解的仅仅是其最基本的功能，信得科技猪病检测中心愿与各位共勉，深入发掘实验室检测在健康养殖中发挥的作用，让养殖更安心。
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