养殖管理频道
养殖管理  畜禽资源  免疫防疫  疫病防治  疫病警报  饲料  兽药  
当前位置:首页疫病防治专家诊室 → 文章内容

我国首例非洲猪瘟的确诊


现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2018/8/8 16:07:42 关注:1048 评论: 我要投稿

我国首例非洲猪瘟的确诊

  王清华1,任炜杰1,包静月1,戈胜强1,李金明1,李 林1,樊晓旭1,刘春菊1,王 华1,张永强1,徐天刚1,吴晓东1,段亚良2,顾贵波2,周晨阳2(1. 中国动物卫生与流行病学中心,国家外来动物疫病研究中心,山东青岛 266032;2. 辽宁省动物疫病预防控制中心,辽宁沈阳 110164)

    摘要:近日,辽宁省沈阳市一养猪户饲养的猪陆续发生不明原因死亡,病死猪剖检发现脾脏异常肿大,疑似非洲猪瘟病毒感染。经国家外来动物疫病研究中心裣测,确诊为非洲猪瘟病毒核酸阳性,B646L/p72基因序列417个碱基与俄罗斯毒株100%匹配,与俄罗斯和东欧目前流行的格鲁吉亚毒侏( georgia2007)属于同一进化分支。这是我国发现的首例非洲猪瘟,疫情来源有待进一步调查。
  关键词:非洲猪瘟;非洲猪瘟病毒; 荧光定量PCR ;普通PCR ;ASFV 特异性抗体中图分类号:S852.65  文献标识码:A
  非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起猪的一种急性、热性、高度接触性动物传染病,临床上以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征,易感猪群的病死率高达100%。鉴于该病的严重危害性,世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病,我国将其列为一类动物疫病。ASFV 不感染人,对人的健康不构成威胁。目前,针对ASF 防控,尚无有效的商品化疫苗。
  2018 年8 月1 日,国家外来动物疫病研究中心接到辽宁省沈阳市沈北区发现ASF 临床可疑病例的报告(图1)。截至8 月1 日,发病猪场累计死亡47 头,对刚病死的2 头猪剖检发现:脾脏极度肿大,严重梗死,质脆易碎,其中一头猪脾肿大至少10 倍,一头猪脾肿大5~7 倍;肺出血、质硬,有间质性肺炎变化;下颌淋巴结、肠系膜淋巴结出血,切面呈大理石样变;胃浆膜面弥漫性出血;肾肿胀明显、色淡,未见出血点;扁桃体见陈旧性出血,符合ASF 症状。国家外来动物疫病研究中心立即开展病原学检测,证实本次疫情由ASFV引起。这是我国历史上的首次ASF 发病记录。
  图1 发病场地理位置


  1 材料与方法
  1.1 病料
  病原学样品:分别来源于2 头病死猪的剖检病料,包括全血、脾脏、淋巴结、扁桃体;30 头临床健康猪的全血。
  血清样品:2 头病死猪及同群30 头临床健康猪血清。
  1.2 病料DNA 提取
  在加有陶珠的组织匀浆管(Roche)中,加入600 μL PBS 缓冲液,再加入剪碎的组织样品约30mg,使用HyBaid RiboLyser 组织匀浆机进行匀浆处理。取200 μL 组织匀浆液和全血,分别使用病毒DNA 提取试剂盒提取DNA。最后将提取的核酸于?80 ℃冰箱中保存备用。
  1.3 荧光定量PCR
  依据文献报道[1],用本实验室建立的OIE 推荐的ASFV 特异的荧光定量PCR 方法进行ASFVp72 基因片段的扩增。ASFV 特异性引物为king-s/king-a,TaqMan 探针为ASFVP,同时以本试验室合成的质粒DNA 标准品为阳性对照。
  1.4 普通PCR
  依据文献报道[2],用本实验室建立的OIE 推荐的ASFV 特异的PCR 方法进行ASFV p72 基因片段的扩增。ASFV 特异性引物为PPA1/PPA2,产物长度为257 bp,同时以本试验室合成的质粒DNA 标准品为阳性对照。
  1.5 测序片段PCR 扩增
  依据文献报道[3-4],合成扩增p72 基因分型的通用型引物(p72-D/p72-U)。引物由上海生工生物技术有限公司合成。采用高保真的Phusion High-Fidelity PCR Master Mix 扩增B646L/p72 基因片段,预期扩增片段大小478 bp。50 μL 的PCR 反应体系为:2X Phusion Master Mix 25 μL,p72-D(10μmol/L) 和p72-U(10 μmol/L) 各2 μL, 模板DNA 2 μL,用灭菌水补齐体积至50 μL。PCR 反应程序为:98 ℃预变性30 s;然后进行35 个PCR 循环(98 ℃ 10 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s);最后72℃ 10 min。
  1.6 PCR 产物测定
  将扩增产物使用1% 的琼脂糖凝胶电泳,然后切胶回收,对回收的DNA 直接用于测序。序列拼接采用Lasergene 7.1 软件(DNASTAR Inc.Madison,WI,USA) 中的EditSeq 与MegAlign模块。多序列的比对和遗传进化树的绘制,应用MEGA 5.0 软件进行。其他国家的参考毒株序列从GenBank 中获得。
  1.7  抗体检测
  西班牙INGENASA 公司生产的非洲猪瘟阻断ELISA 抗体检测试剂盒,批号为050218。法国ID-vet 公司生产的非洲猪瘟间接ELISA 抗体检测试剂盒,批号为B71。国家外来动物疫病研究中心自主研发的非洲猪瘟间接ELISA 试剂盒,批号为201801。INGENASA 公司生产的非洲猪瘟阻断ELISA 试剂盒包被抗原为p72 蛋白,IDvet 公司生产的非洲猪瘟间接ELISA 试剂盒包被抗原为p30、p62、p72 重组蛋白, 自主研发的非洲猪瘟间接ELISA 试剂盒包被抗原为p30 蛋白。
  2 结果
  2.1 荧光定量PCR
  荧光定量PCR 检测结果显示,采自2 只病死猪的8 份组织样品和全血中都能检测到ASFV 特异性扩增曲线,Ct 值为19.14~26.5(图2)。


  扩增曲线的横坐标为扩增循环数,纵坐标为荧光强度;绿色横线位置为荧光强度的阈值,对应的循环数为临界循环数(CT);CT值低于40 判定为阳性;图中扩增曲线从左至右依次为P、全血1、脾1、全血2、淋巴结2、肾2、淋巴结1、肾1、脾2

    图2 实时定量PCR 扩增结果

  2.2 普通PCR
  ASFV 普通PCR 扩增结果显示,7 个样本(分别为全血1、淋巴结1、肾1、脾1、全血2、淋巴结2、肾2)在257 bp 左右有特异性扩增条带,与阳性对照一致(图3)。样本脾2 特异性扩增条带较弱。
  1~8. 全血1、淋巴结1、肾1、脾1、全血2、淋巴结2、肾2、脾2;P. 阳性对照;N. 阴性对照;M. 分子量标记(由上至下分别为2000、1000、750、500、250、100 bp

    图3 普通PCR 检测结果


  2.3 p72 基因片段序列遗传进化分析
  对样本B646L/p72 基因片段普通PCR 产物进行正反向测序,对得到的序列进行拼接后获得p72基因片断序列,长度为417 bp(图4)。对扩增的P72 基因序列,应用邻接法(Neighbor-joining)绘制了遗传发生树(图5)。结果显示,该样本病毒属于基因II 型,与目前在俄罗斯和东欧流行的格鲁吉亚毒株(Georgia 2007)同属于一个进化分支。
  2.4  抗体检测
  对32 份血清样品的ASFV 特异性抗体检测结果均为阴性。

  图4 样本p72 基因片段测序结果


  图5 P72 基因遗传进化分析


  3 讨论
  ASFV 是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae) 非洲猪瘟病毒属的唯一成员,基因组为双股线状DNA,大小为170~190 kb。根据病毒编码主要衣壳蛋白p72 的B646L 基因,可将该病分为24 个与地域性相关的基因型[5-6]。基因II 型流行于非洲东南部,2007 年传至格鲁吉亚,并扩散到俄罗斯联邦和东欧地区[7],已在高加索地区定殖;2017 年,该基因型病毒向东长距离跨越式传播至俄罗斯远东地区伊尔库茨克[9],导致传入我国的风险空前升高。目前,ASF 已经成为困扰欧洲养猪业的一个重要问题[8]。该病跨国界传播能力和危害性使其成为全球性的问题。
  本次疫情是我国确诊的首例非洲猪瘟。该猪场生物安全条件较差,紧临车辆繁忙的乡间公路,场区出入口无消毒池。病死猪在当地兽医部门监督下就近掩埋处理,有相应的生猪保险理赔记录。剩余存栏生猪336 头,临床未见异常。据了解,死亡猪多为100 kg 的大猪。p72 基因片段遗传进化分析显示,本次暴发流行的毒株为基因II 型,与俄罗斯及东欧流行的毒株属同一分支,提示疫情可能来自俄罗斯和东欧疫情国家。为进一步确定病毒与俄罗斯和东欧流行株的差异,正在对全基因组序列进行分析。值得注意的是,该起疫情的病死率虽然很高(100%),但发病率和死亡率较低,发病高峰期10 头左右,平常日均死亡3 头左右。此外,同群猪临床健康,随机采集30 头猪的抗凝血、血清样品的病原学检测结果和血清学检测结果均为阴性,提示该起疫情毒株的群内传播能力或有一定局限性。
  感染生猪及其产品的移动是导致疫情快速远距离传播的主要途径。尤其值得注意的是,ASFV在未经高温处理的肉品中存活能力很强,未经高温处理的泔水、烟熏肉、风干肉、腌肉、火腿等也是造成病毒跨区域传播的重要因素。历史上,多起跨境传播的ASF 疫情与航空器、列车运载上述猪肉制品的处理不当、感染ASF 野猪移动有关[10]。目前,应加强流行病学调查和主动监测排查工作,特别对病死猪的检测,应重点关注屠宰场、病死生猪无害化处理场等高风险场点,对已发现的确诊病例要做进一步追溯排查;加大科普宣传,发动养猪户、诊疗人员和相关从业人员主动上报可疑情况。若发生疫情,应严格按照《非洲猪瘟疫情应急预案》和《非洲猪瘟防治技术规范》进行处置。
  致谢:
  中国动物卫生与流行病学中心王志亮总兽医师在疫情调查和检测分析过程中给予悉心指导,辽宁省动物疫病预防控制中心积极协助调查并提供样品。

文章来源:pig333     文章编辑:一米优讯     
进入社区】【进入专栏】【推荐朋友】【收藏此页】【 】【打印此文】【关闭窗口
 相关信息
2024年第11周国际非洲猪瘟疫情汇总2024/3/28 21:46:26
2024年第11周国际非洲猪瘟疫情汇总2024/3/28 19:46:26
意大利通报皮埃蒙特大区等4地发生43起野猪非洲猪瘟疫情2024/3/28 18:44:43
意大利通报皮埃蒙特大区等4地发生43起野猪非洲猪瘟疫情2024/3/28 16:44:43
意大利通报皮埃蒙特大区等4地发生43起野猪非洲猪瘟疫情2024/3/28 14:44:43
哈兽研在解析非洲猪瘟病毒感染致病机制方面取得重要进展2024/3/28 8:01:32
 发表评论   (当前没有登录 [点击登录])
  
信息发布注意事项:
  为维护网上公共秩序和社会稳定,请您自觉遵守以下条款:
  一、不得利用本站危害国家安全、泄露国家秘密,不得侵犯国家社会集体的和公民的合法权益,不得利用本站制作、复制和传播下列信息:[查看详细]
  二、互相尊重,对自己的言论和行为负责。
  三、本网站不允许发布以下信息,网站编辑有权直接删除:[查看详细]
  四、本网站有权删除或锁定违反以上条款的会员账号以及该账号发布的所有信息。对情节恶劣的,本网将向相关机构举报及追究其法律责任!
  五、对于违反上述条款的,本网将对该会员账号永久封禁。由此给该会员带来的损失由其全部承担!
声明:本网刊登的文章仅代表作者个人观点,文章内容仅供参考,并不构成投资建议,据此操作,风险自担。如果转载文章涉嫌侵犯您的著作权,或者转载出处出现错误,请及时联系文章编辑进行修正,电话:010-65283357。本网原创文章,转载请注明出处及作者。感谢您的支持和理解!

您可能感兴趣的产品更多>>

版权所有 现代畜牧网 Copyright©2000-2023 cvonet.com All Rights Reserved 京ICP备10042659号