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非洲猪瘟病原学诊断


现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2019/4/15 10:56:39 关注:39 评论: 我要投稿

  非洲猪瘟(African Swine Fever ,ASF)是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,又称非洲猪瘟疫或疣猪病。目前缺乏针对非洲猪瘟的有效疫苗,且非洲猪瘟的传播非常迅速。由于非洲猪瘟引起的临床症状跟猪的其他一些传染病相似,根据临床症状很难进行鉴别诊断,因此实验室诊断和严格的生物安全措施对该病的防控至关重要。目前,国际上主要通过病原学和血清学方法进行非洲猪瘟的诊断。然而,该病在我国属于外来病,非洲猪瘟引起的临床病程短、发病急,通常在病毒抗体产生之前,动物已经发病死亡。因此,目前我国非洲猪瘟的检测主要应用病原学检测方法。本文主要对目前常用的非洲猪瘟病原学检测技术进行综述。
  非洲猪瘟病毒可引发从最急性、 急性到慢性和表现健康实际带毒的一系列广泛症状。根据毒株之间毒力的不同,非洲猪瘟产生的临床症状也有所不同。其中,急性症状是最为常见的(3-5天),5-10天左右致死。慢性症状则通常表现为消瘦,肿胀和呼吸道问题。非洲猪瘟的临床症状主要表现为发热、出血以及皮肤发绀,甚至出现血块。病理剖检后通常可见脾脏异常肿大和淤血,淋巴结、肝脏和肾脏出血,这些临床症状与古典猪瘟、蓝耳病、伪狂犬病等很难区分,因此一般通过实验室手段进行非洲猪瘟的鉴别诊断。快速,灵敏并且特异的检测技术对于非洲猪瘟的防控是至关重要的,不仅可以预防非洲猪瘟病毒的传播扩散,更有助于区分与非洲猪瘟有相似临床症状的一些疾病。
  一、病毒分离
  非洲猪瘟病毒可以通过血液、血清以及其他组织样品(脾脏、肝脏、淋巴结和扁桃体)等进行分离。如果样品中存在非洲猪瘟病毒,感染细胞中会产生明显的细胞病变(CPE)。非洲猪瘟病毒的红细胞吸附实验是其特有的检测技术,其它猪源病毒在白细胞培养物中不存在红细胞吸附特性。细胞病变通常出现在红细胞吸附48-72小时后,红细胞吸附反应(HAD)是基于猪源红细胞会吸附在感染非洲猪瘟病毒的单核巨噬细胞周围从而产生红细胞吸附的现象。该试验需要非洲猪瘟病毒在猪的原代骨髓细胞、肺泡巨噬细胞或外周血白细胞中培养,试验方法已经在世界动物卫生组织(OIE, 2012)手册详细描述。红细胞吸附试验方法的主要缺点是需要制备原代细胞,而且证明它的阴性结果至少需要6天。然而,如果红细胞吸附试验在前24h为阳性的话,通过红细胞吸附试验进行的病毒分离是优先于ELISA,PCR以及荧光抗体试验(FAT)。即使使用其他方法以及验证非洲猪瘟病毒为阳性的情况,通常建议使用红细胞吸附试验进行确诊,尤其是检测首次爆发或首例非洲猪瘟疫情。
  二、非洲猪瘟病毒抗原检测
  1. 荧光抗体试验
  荧光抗体试验用来检测疑似病例组织中的非洲猪瘟病毒。试验方法是将疑似病例的组织或器官涂抹在载玻片或冷冻切片切成薄片,使用荧光素标记的特异抗体染色后通过显微镜观察非洲猪瘟病毒的抗原。荧光抗体试验也可以检测红细胞吸附阴性的白细胞,同时也可以鉴定没有红细胞吸附现象的非洲猪瘟病毒株。虽然荧光抗体试验对非洲猪瘟急性期的检测非常敏感,但对于亚急性和慢性症状,由于抗原抗体复合物的形成阻碍了非洲猪瘟抗原表位簇与标记荧光素抗体的结合,导致该试验的敏感性会降低。
  2. 抗原检测ELISA技术
  ELISA技术可以用于非洲猪瘟病毒抗原的检测,但只适用于急性症状的非洲猪瘟感染,但抗原检测ELISA不如PCR方法敏感。首次研究的间接ELISA方法检测非洲猪瘟病毒抗原的浓度范围在50-500HAD50/ml,之后以VP72的单克隆抗体建立的夹心ELISA方法提高了试验的敏感性。据报道,目前使用的两种双抗夹心ELISA检测试剂盒,一种是使用多克隆抗体,另一种是结合使用单克隆和多克隆抗体。两种方法都可以检测到较为广泛的非洲猪瘟毒株,但相比单克隆抗体,使用多克隆抗体检测非洲猪瘟病毒抗原要较为敏感。
  三、非洲猪瘟病毒分子生物学试验检测
  非洲猪瘟病毒的基因组大小在170到190kb之间,一条线性双链DNA分子,编码至少150个蛋白。根据不同毒株的差异,编码的蛋白数目也有所不同,据报道非洲猪瘟病毒可以分为24个基因型。分子生物学检测方法,通常基于保守基因设计引物,能保证扩增到所有基因型的非洲猪瘟病毒。目前OIE非洲猪瘟参考实验室将实时荧光定量PCR当作检测非洲猪瘟病毒的金标准。相比实时荧光PCR而言,等温扩增的分子检测方法价格低廉,在发展中国家应用具有很大的潜力。
  1. 聚合酶链式反应(PCR)
  针对非洲猪瘟病毒基因的检测,已经研制出很多种常规PCR方法。虽然这些方法目前都被实时荧光定量PCR所代替,但是在一些没有实时荧光定量检测设备的实验室,常规PCR仍然非常有用。
  2. 实时荧光定量PCR(RT-PCR)
  实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进行实时监测。相比常规PCR方法,实时荧光定量更加快速,灵敏,减少交叉污染以及能够对监测结果进行定量。而且,实时荧光定量PCR可以使用96孔板,更加高效与自动化。目前已经有便携式的实时荧光定量设备,这将给未来的临床诊断带来根本性的改变。
  King等首次报道的TaqMan实时荧光PCR详细步骤已收集在OIE手册中(OIE,2012)。该试验方法很敏感且又特异,可以检测到10到100个病毒基因的拷贝数。这个方法在25种不同非洲猪瘟病毒株以及非洲和欧洲16种蜱分离毒株中得以验证,而且与其它猪病没有交叉反应。Zsak等研究的另外一种基于VP72的TaqMan实时荧光PCR可便携的仪器,因此简化了试验前后的步骤。同时,这个方法有非常高的敏感性与特异性。与前一种方法相比,它可以检测到1.4到8.4个病毒基因的拷贝数。第三种实时荧光定量PCR是Mckillen等利用DNA双螺旋上的小沟(MGB)结合物探针来扩增非洲猪瘟病毒的9GL基因,它可以检测到至少20个病毒基因拷贝数,这种方法已经在15种非洲猪瘟病毒株以及相似猪病得以验证。目前由包括兰州兽医研究所等多家单位共同起草、由中国兽医协会发布的T/CVMA5-2018非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法在我国非洲猪瘟病毒检测中发挥重要作用。
  3. 多重PCR
  Felicity等已经建立了多重实时荧光定量PCR方法来同时检测和区分非洲猪瘟和猪瘟病毒。它的敏感性对两种病毒都达到了100%,它的特异性对猪瘟是100%,而对非洲猪瘟是97.3%。常规多重PCR可以同时检测出多种猪源病毒,该方法使用多对针对各自病毒的不同引物,因为可以扩增出不同条带的片段,因此可以在琼脂糖凝胶电泳中加以区分。虽然,它的敏感性比单一常规PCR降低10倍左右,但是,可以同时检测出多种猪源病毒。
  4. 等温扩增反应
  虽然RT-PCR方法在检测非洲猪瘟病毒时的敏感性和特异性都很高,但因为这些方法都需要比较昂贵的实验设备。等温扩增试验就为了基层等条件较为落后的实验室提供了一种选择。等温扩增技术检测非洲猪瘟病毒是一种非常有效的实验室检测手段。相比较其他方法,等温扩增试验只需要一个恒温水浴锅,不需要昂贵的热循环设备。其中一种等温扩增方法是基于环介导等温扩增反应(LAMP)原理建立的检测方法,通过检测38种不同的非洲猪瘟病毒株来比较该方法与其他检测方法。结果显示,它可以检测出330个病毒基因拷贝数,敏感性低于其他试验方法。但是,对检测非洲猪瘟致死的猪群,这种方法的敏感性也很高。
  四、RT-PCR、LAMP和抗原ELISA 检测方法比较试验OIE参考实验室IAH-Pirbright通过试验比较了一种实时荧光定量PCR,一种商品化的抗原ELISA和一种LAMP方法。实验样品选自试验感染动物和疑似自然感染动物。对于试验感染动物,使用非洲猪瘟毒株(OURT88/1)攻毒感染后5天收集样品进行检测。RT-PCR和LAMP试验方法检测全部18头份都是阳性,RT-PCR的Ct值都比较低,表明了试验动物病毒DNA的拷贝数很高,LAMP试验方法在不到30分钟检测出所有阳性。抗原ELISA的检测结果发现只有14头份动物是阳性,3头份不确定,还有一头份是阴性。阴性动物对所有方法的检测都是阴性。这个结果表明了RT-PCR和LAMP在检测非洲猪瘟急性症状样品时的敏感性要好于抗原ELISA。田间样品选自2004到2009年来自加纳疑似感染非洲猪瘟病毒动物。在所有46份样品中,RT-PCR检测34份是阳性,LAMP检测33份是阳性。唯一的一份LAMP检测是阴性,但它的RT-PCR的Ct值也非常高。当LAMP的Tp值调到40时,它的敏感性就和RT-PCR一样了,这表明了Tp值在LAMP试验中的重要性。而将这些样品用于抗原ELISA时,只有14份是阳性,10份不确定性,22份是阴性。这个结果表明了抗原ELISA的敏感性要远远低于RT-PCR和LAMP方法,这可能是由于田间样品的纯度造成的。虽然抗原ELISA比RT-PCR和LAMP的敏感性都低,但当临床检测紧急爆发非洲猪瘟时,抗原ELISA还是能够成功检测出非洲猪瘟病毒。
  五、结语与展望
  综上所述,目前可用于非洲猪瘟病毒检测的诊断技术有病毒检测和抗体检测,本文主要介绍了病毒检测的方法。实时荧光PCR是最为广泛、有效的病毒学诊断技术,敏感、特异、快速并且高通量地实现非洲猪瘟病毒的检测。由于存在交叉污染的可能,应采取其他检测方法比对,并且结合血清学、病理学和流行病学调查的结果综合诊断。另外,由于PCR所检测到的阳性仅仅是病毒核酸阳性,因此,除PCR之外,在新的疑似感染地区报告疫情前,建议先从疑似样品中分离获得病毒才能确诊非洲猪瘟。
  中农威特质量管理部 孙彩琴
文章来源:执业兽医     文章编辑:一米优讯     
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