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口蹄疫诊断技术新进展
现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2019/9/22 21:37:53 关注：532 评论： 我要投稿
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口蹄疫诊断检测技术正在不断地改进和创新，已从细胞培养、血清学诊断技术领域扩展到了分子生物学诊断技术领域。这些新技术不仅敏感、特异，而且还简便、快速、高通量化。
一、病原学检测技术
1. 新高敏感细胞系
因牛甲状腺原代细胞和羔羊肾原代细胞在生产上存在问题，尤其是很少进行口蹄疫诊断的实验室以及因口蹄疫呈地方流行性的地区口蹄疫阴性的动物很难得到。而现有的细胞系在对口蹄疫病毒的敏感性上又有局限性，因此，学者进行了寻找和构建对口蹄疫病毒更加敏感的细胞系的研究。Brehm（2009）等建立了高敏感山羊胎儿细胞系（ZZ-R 127），结果表明，在分离7个血清型的口蹄疫病毒上比其他现有的细胞系更加敏感，并且其试验结果与牛甲状腺原代细胞细胞的结果相差在0.5个log范围以内，并且ZZ-R 127细胞还可以分离猪水泡病毒和水泡性口炎病毒。由于整联蛋白αvβ6是口蹄疫病毒的主要受体，LaRocco（2013）将αv亚基和β6亚基同时导入到牛肾细胞系中构建稳定表达αvβ6的细胞系LFBK-αvβ6，结果表明β6亚基至少在100代可以稳定表达，并且增加了其对口蹄疫病毒的易感性。LFBK-αvβ6细胞系在检测所有7个血清型的病毒上都具有很高的敏感性，并且与其他现有的细胞系相比较，该细胞系在检测临床样品上更加有效。
2. 分子生物学诊断技术
（1）环介导逆转录等温扩增技术
口蹄疫的传统诊断方法是由特异性病毒抗原的酶联免疫吸附试验检测所介导的，通过观察细胞培养中的病变效应。另外，常规反转录聚合酶链式反应和实时定量聚合酶链式反应用来补充口蹄疫病毒感染的最初诊断方法。然而，这些方法比较费力，并且需要昂贵的实验室设备。为解决这些问题，建立了一个简单的、快速的和实用的反转录环介导等温扩增（RT-loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）方法鉴定动物及其产物中的口蹄疫病毒。反转录环介导等温扩增方法首先是由Notomi等人报道的，并且成功用于许多动物病毒的检测，其结果可以通过2.5%琼脂糖凝胶电泳判定，其中添加核酸染料SYBR Green I。目前已在人类及动植物细菌、病毒、寄生虫、真菌等病原体的检测中取得重要进展，在疫病诊断领域显示出广阔的应用前景。反转录环介导的等温扩增是一个敏感性试验，它操作非常简单，只需要传统水浴或加热器在等温条件下孵育。另外一个特点是它的产物可以直接用肉眼观察，是因为在反应管中形成了一个焦磷酸镁的白色沉淀。此方法比较省时，其结果可以在一个小时之内观察，然而普通的反转录聚合酶链式反应确需要2～4h。它的成功应用取决于4～6对引物和口蹄疫病毒目标序列的高度匹配。口蹄疫病毒准种特性可能会减少反转录环介导的等温扩增实验的敏感性，因此，在实际应用之前，我们需要用大量的野生毒株来评估其敏感性。如果此方法可以进一步开发为可以直接与临床样本，如上皮组织，OP液体等而不是提取的RNA直接反应，那么它将有潜力成为一种快速诊断方法而进行现场检测。口蹄疫病毒反转录环介导的等温扩增现场诊断的敏感性和特异性需要进一步研究。李健等利用此技术建立了口蹄疫病毒快速检测方法，同时评价了该方法的灵敏性和特异性。结果表明，根据口蹄疫病毒多聚蛋白基因保守区段设计的录环介导等温扩增引物能够在65℃下，1h内实现目标核酸区段的大量扩增，检测结果可直接用肉眼判断。该检测体系具有极高的特异性，只能检测到目标病毒，与其他类似病毒如猪水泡病病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒等无交叉反应，可检测到10-5稀释度的目标病毒核酸量，比普通反转录聚合酶链式反应的灵敏性高100倍，比荧光聚合酶链式反应高10倍。
（2）实时荧光定量反转录聚合酶链式反应
荧光实时定量聚合酶链式反应就是通过对聚合酶链式反应扩增反应中的每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在其反应中引入了一种荧光化学物质，随着聚合酶链式反应反应的进行，聚合酶链式反应反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的，从而得到荧光扩增曲线图。相比常规聚合酶链式反应技术，荧光实时定量聚合酶链式反应的特异性强，灵敏度高，可直接对产物进行定量，自动化程度高，操作简单，亦解决聚合酶链式反应污染问题。TapMan反转录聚合酶链式反应是利用共振能量转移达到荧光猝灭而距离增加后荧光恢复的技术的原理建立的一种先进的荧光实时定量反转录聚合酶链式反应技术，因其高度的敏感性、特异性，正逐步取代普通反转录聚合酶链式反应方法，广泛应用于口蹄疫病毒的检测。卢受昇等基于口蹄疫病毒聚合酶3D蛋白基因的序列分析，设计合成了特异的引物和探针，通过反应条件的优化，建立了实时TaqMan荧光定量反转录聚合酶链式反应检测方法。试验表明，该方法能特异性检测A、O、Asia1型3种血清型的口蹄疫病毒，对猪水泡病、猪瘟、蓝耳病等猪常见病原检测结果均为阴性。对比检测试验表明，该方法的检测敏感性比常规的多重反转录聚合酶链式反应提高达105倍，对口蹄疫病毒细胞增殖病毒液的检测灵敏度可达0.063个TCID50。对临床样品的检测试验证实，该方法可以有效检测临床样品中的猪水泡皮、组织、血清及OP液中的口蹄疫病毒。李金海等亦根据口蹄疫病毒聚合酶3D基因建立了实时TaqMan荧光定量反转录聚合酶链式反应检测方法。该方法分别以质粒和病毒RNA为模板，通过优化，得到最佳反应体系和反应条件。结果显示能特异性检测A、O、Asia1型口蹄疫病毒，而对猪瘟、猪蓝耳病、猪圆环病毒、猪细小病毒、猪狂犬病毒、猪乙型脑炎等病原检测结果均为阴性。构建的荧光定量标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系，检测质粒的敏感性可达83.4拷贝/uL，检测病毒RNA的敏感性可达7.1拷贝/uL，比多重反转录聚合酶链式反应敏感性高10倍。对4份样品进行5次批内和批间重复检测，检测结果变异系数均小于2%。石立立等将改良的实时TaqMan荧光定量反转录聚合酶链式反应技术应用于口蹄疫病毒感染体内和体外的定量检测以及其3D基因转录水平分析。结果表明:对样品中口蹄疫病毒基因组RNA的检测灵敏度可达l0个基因拷贝，可同时检测病毒正负链复制水平且重复性较好，所测口蹄疫病毒3D基因转录水平可高达6.9×104拷贝/微升；与实时SYBRGreen Ⅰ 染料反转录聚合酶链式反应技术比较，改良的实时TagMan荧光定量反转录聚合酶链式反应技术检测灵敏度高6.7倍。以上结果证实，改良的实时TaqMan荧光定量反转录聚合酶链式反应技术在病毒检测和基因表达水平分析方面有更高的灵敏度和特异性。此外，高志强等根据口蹄疫病毒Asia1型VP1的基因编码区基因（1D）序列，设计合成多对引物和多条探针，通过对引物、探针的筛选，反应条件的选择和优化，建立了口蹄疫病毒Asia1型荧光反转录聚合酶链式反应检测技术。该试验采用一对引物和两条探针配对，有效降低了由于变异导致的漏检率。经一系列的试验表明建立的荧光聚合酶链式反应检测技术快速、敏感、特异，检测时限3h以内，与口蹄疫病毒A型、O型和其他病毒不发生交叉反应，适用于样品中口蹄疫病毒Asia1型的直接检测。
（3）高敏感金颗粒改良免疫聚合酶链式反应
2，2-联喹啉-4，4-二甲酸二钠 （BCA）是一种稳定的水溶性复合物，可以用于目标蛋白和核酸的超灵敏检测，其最小检测量为30aM。此方法成功用于多种动物病毒的检测，并且提供了优于酶联免疫吸附试验和传统聚合酶链式反应的超高分析灵敏度。基于BCA的原理，建立了高度敏感的金纳米颗粒改良免疫聚合酶链式反应方法（highly sensitive gold nanopariticle improved immuno-PCR， GNP-IPCR），用于检测口蹄疫病毒抗原。通过多克隆抗体或单克隆抗体捕获的目标病毒粒子包被酶联免疫吸附试验微型板，随后用高度敏感的金纳米颗粒孵育，它已经被寡核苷酸和口蹄疫病毒特异性单克隆抗体改进。在免疫复合物形成和几步洗板之后，信号DNA通过热释放，并且用聚合酶链式反应或实时定量聚合酶链式反应方法进行分析。此方法结合了酶联免疫吸附试验抗原检测适用性和聚合酶链式反应方法高度敏感性，因其高的信号扩增性而具有超高分析灵敏度。高度敏感的金纳米颗粒改良免疫聚合酶链式反应可以检测到的极限是10fg/mL纯化的样品，相比酶联免疫吸附试验的极限100ng/mL要高很多。但是高度敏感的金纳米颗粒改良免疫聚合酶链式反应的特异性也很容易因清洗不彻底而受影响。高度敏感的金纳米颗粒改良免疫聚合酶链式反应仍然是免疫聚合酶链式反应的改进实验。
（4）基因芯片技术
基因芯片技术是分析基因表达和单核苷酸多态性的一种方法。口蹄疫的基因芯片诊断技术是指利用DNA芯片进行口蹄疫病毒的检测。DNA芯片是随着人类基因组计划的完成而逐步发展起来的。DNA芯片的原理是杂交测序方法，即通过将样本核苷酸与一组已知核酸序列的探针杂交进行核酸序列测定的方法，将这些已知序列的靶核苷酸的探针按阵列固定在一块基片表面，从而达到高通量测定的目标。利用DNA芯片进行口蹄疫诊断时，首先需要将具有代表性血清型的VP1或3A核酸片段点阵于基因芯片上，然后将待检样本的cDNA或RNA进行荧光分子标记，将标记核酸分子与芯片上的靶探针进行杂交，然后通过相关荧光采集系统对芯片上的荧光进行扫描采集，分析信号读取和转化数据，将获得的数据进行分析，从而鉴定出样本是否感染口蹄疫病毒。利用DNA芯片还可以进行口蹄疫病毒血清型和基因型的判定，因为其高度灵敏性完全可以达到区分口蹄疫病毒不同血清型和基因型的标准。DNA芯片诊断技术的突出特点是高通量、高集成、微型化和自动化，其与传统的检测方法相比，该方法可以在一张芯片上，同时对多个样本进行多种疾病的检测。该技术被认为是继基因克隆技术、基因测序技术和聚合酶链式反应技术后的又一次革命性的技术突破，因此在未来有广泛的应用前景。该技术的缺点是相对技术要求较高，仪器设备相对昂贵。
利用基因芯片可以将口蹄疫病毒和其他病毒进行区分，而且可以区分口蹄疫病毒的不同变种。鉴别相同病毒的不同突变毒株是对病毒的变异能力、准种分布情况和特点、病毒变异对表型产生的影响，以及易变区段进行分析的必要手段。现在已经建立了包含有155个口蹄疫病毒基因组寡核苷酸探针的基因芯片。这些探针长度约为35～45bp长，具有血清型特异性，可以检测VP3和VP1-2A基因。基因芯片扩增的片段标记有Alexa-Fluor 546染料，可以进行基因定性和定量分析。代表7个不同血清型的23个口蹄疫毒株被进行了分析，结果证实该方法可以口蹄疫病毒的检测和血清型的区分。在这种基因芯片上增加其他病毒基因的探针还可以进行其他病毒的检测。因此基因芯片方法可以进行高通量检测口蹄疫病毒，而且可以对口蹄疫病毒基因组进行核苷酸多态性分析。
（5）二代测序
在检测口蹄疫病毒的分子生物学方法建立以后，核酸测序方法就是一种应用非常广泛的检测方法。测序方法在血清型鉴定和突变分析有力的工具。传统的测序方法都是通过检测口蹄疫病毒的VP1基因进行口蹄疫病毒表型分析和血清型鉴定的。随着测序技术的发展，新的测序方法也逐步建立起来，其中二代测序技术的优势比较突出。
二代测序（next generation sequencing，NGS）技术的核心是边合成边测序，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA序列。其原理是每一个dNTP的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来，通过检测化学发光信号的有无和强度，达到实时检测DNA序列的目的。利用二代测序技术，序列数据可以从一个样本中产生，并且提供了一个前所未有的”阶梯式”增加。尽管二代测序经常用在大基因组的重新测序，它也可以用在短病毒基因组的重新测序以得到深度覆盖区。因此，对一个病毒样本来说，二代测序有潜力通过揭示仅仅存在于小片段上的核苷酸替换来提供额外的信息。一些早期研究使用454焦磷酸测序平台检测人类病毒少数序列变异。454焦磷酸测序有前途的替换方法是由Illumina测序平台提供的基于终止子的可逆序列化学过程。此方法运行成本低且效率高，使之很可能广泛用在未来深度基因组测序中。Wright等证明了此方法是一个强大的和有价值的工具，可以用来解剖口蹄疫病毒种群与宿主之间的关系。
（6）生物传感器检测技术
一种基于压电晶体的免疫生物传感器已经被建立，用于进行口蹄疫的诊断和病毒的分型。变构效应生物传感器利用病毒蛋白和抗体相互作用的原理，将病毒表面蛋白的部分肽段插入到β重组半乳糖苷酶的构象反应区，作为检测血清中口蹄疫抗体的受体。当抗体与这些肽段结合后则能够引起酶促反应，从而可以快速的进行检测。生物传感器检测技术已经被用于HIV病毒的检测，可以大量快速的进行多样本检测。因此该方法在口蹄疫检测方面也具有很大的前景。
已经有报道将口蹄疫病毒VP1的B细胞表位插入到β重组半乳糖苷酶活化位点附近，在有该表位抗体存在的情况下，β重组半乳糖苷酶可以迅速活化，引发酶促反应，因此可以用于检测感染了口蹄疫病毒的动物的血清。另外，将口蹄疫病毒非结构蛋白3B的部分肽段插入到β重组半乳糖苷酶，利用3B蛋白的单克隆抗体可以显著激活酶促反应。同样，利用口蹄疫病毒感染的动物的血清，也可以激活酶促反应。因此，这种方法在口蹄疫诊断过程中，可以对健康动物、疫苗免疫动物和自然感染动物进行区分。具有重要的应用价值。
（7）基于核酸的诊断方法
利用放射性标记物对探针进行标记可以用于1pg病毒RNA或者对一个细胞中的一个病毒进行检测。基于这种利用核酸序列扩增的技术（NASBA）进行口蹄疫病毒检测的方法已经被建立，根据检测手段不同分为电化学发光核酸序列扩增的技术（NASBA-ECL）和酶联寡核苷酸捕获技术（NASBA-EOC）两种方法。核酸序列扩增的技术诊断方法可以快速，高灵敏地对口蹄疫病毒进行检测和鉴定。
（8）线性指数聚合酶链式反应
线性指数聚合酶链式反应 （linear-after-the-exponential-PCR， LATE-PCR ）是在在不对称聚合酶链式反应的基础上发展出来的，使数量限制的引物比过量的引物的解链温度更高，从而维持较高的反应效率。此方法是一种高效、灵敏的非对称聚合酶链式反应，也是一种改进的非对称聚合酶链式反应。线性指数聚合酶链式反应可以达到与对称聚合酶链式反应一样高效的扩增效率，在多循环指数期以外仍旧可以扩增出大量的单链DNA。非对称聚合酶链式反应比对称聚合酶链式反应可以产生更灵敏的信号，但是由于其扩增效率是对称聚合酶链式反应的70%～80%，因此在检测病原RNA的过程中应用较少。但是线性指数聚合酶链式反应改进了这种缺点。线性指数聚合酶链式反应已经在病原RNA检测方面有了广泛应用。Reid等2010年建立了检测口蹄疫病毒的线性指数聚合酶链式反应，该方法通过设计可以检测口蹄疫病毒所有血清型的2A/B基因、可以鉴别血清型的VP1基因，对A、C、O、Asia1型、SAT1、SAT2和SAT3型等98个样品进行了检测，结果显示检测准确性高于对称聚合酶链式反应（WRL实验室）。建立的线性指数聚合酶链式反应方法可以鉴别和定量口蹄疫病毒核酸序列，可以用于疫情发生时对口蹄疫病毒的检测。
（9）不对称反转录聚合酶链式反应结合寡聚核苷酸芯片技术随着分子生物学技术的发展，基因芯片技术具有高通量、微量化、可对多种病原和多个基因进行平行检测等优点，具有良好的应用前景。因此，建立口蹄疫病毒寡核苷酸芯片检测技术，仅为有效监测口蹄疫病毒提供新的方法。李金海等根据口蹄疫病毒保守的3D基因序列，设计1对特异性引物和3条寡核苷酸探针。下游引物5’端用Cy3标记，用非对称一步法反转录聚合酶链式反应方法标记样品，再与固定在醛基化玻片的探针陈列杂交，用GenePix4100A扫描杂交芯片，GenePix@Pro5.0软件分析扫描结果，建立了检测口蹄疫病毒的基因芯片检测方法。该方法可特异性检测O、A、Asia1型口蹄疫病毒，特异性强、敏感性高。对25份田间样品的检测结果与中国农业科学院兰州兽医研究所多重反转录聚合酶链式反应检测试剂盒结果完全一致，表明该方法可用于口蹄疫病毒样品的实验室检测，同时也为多种病原联合诊断基因芯片的研制奠定了基础。
二、血清学诊断技术新进展
1.免疫层析快速诊断试纸条
传统的检测方法需要将样品运送到实验室，然后通过精细的设备、稳定的试剂和专业的技术人员进行操作才能够开展。在口蹄疫暴发后，以最快的方式限制口蹄疫的扩散可以最大程度的减少疫情造成的损失，这就非常需要特异、敏感、快速、简单和廉价且适合于大规模现场使用的检测方法，以最快速的方法对口蹄疫进行诊断。免疫层析快速诊断试纸条就相对比较符合这样的要求。免疫层析法（immunochromatography）是一种快速便捷的诊断方法，现在已经被应用于口蹄疫病毒的检测。其原理是将口蹄疫病毒蛋白的特异性抗体固定于硝酸纤维素膜的特定区域，然后利用毛细管现象，进行血清等液体样本的检测。如果样品中含有抗体对应的抗原，则两者能够发生特异性结合。此时，通过结合胶体金或免疫酶染色等方法，可以使得结合区域显示出一定的颜色，从而实现特异性的诊断。该方法可以在野外或没有良好实验条件的地方进行疾病诊断检测，其应用现已逐步扩大。该技术将会为各类动物口蹄疫的检测提供更为广阔的应用空间。免疫层析快速诊断试纸条的缺点在于，其对疾病的检测属于定性检测，结果只有阴性和阳性，而且在进行结果判定时往往带有主观性。因此对于其初步判定的阳性样品需要进一步送经实验室进行检测确认。实验室验证结果显示，相比传统的抗原酶联免疫吸附试验，该方法的灵敏度与之相同甚至更高。但这项检测方法对阳性结果特异性很高，但阴性结果灵敏度低，需要在排除口蹄疫病毒感染之前要做更多的分析。我们可能注意到，虽然有关免疫层析快速诊断试纸条测试方法的有效性研究已经做了很久，但仍然没有被OIE批准使用。现在急需批准该方法作为病毒检测方法。在动物性产品和家畜的国际贸易中，应当尽快使用该测试方法来检测口蹄疫。
免疫层析法中还有一种横向流动免疫层析技术（LFA），它是利用横向流动设备（LFD）进行色谱试纸条检测的方法。横向流动免疫层析技术可以进行快速诊断各类病毒性疾病，在口蹄疫的检测中也被广泛利用，横向流动免疫层析技术检测法，能够快速、简便地应用于现场，检测鼻拭子上皮和食道探子所采样本以及细胞培养继代上清液的口蹄疫病毒抗原。此法对可疑口蹄疫暴发地区，能提供临床证实，有利于疾病的迅速控制，Ferris等利用筛选的一种可以和口蹄疫病毒所有血清型反应的单克隆抗体建立了一种可以检测口蹄疫病毒血清型的免疫层析试纸条，并配套发明了一种在疫区现场可以准备上皮悬液样品的一次性组织搅拌器，建立的这种免疫层析试纸条的敏感性和特异性和实验室建立的抗原酶联免疫吸附试验方法一致。这种试纸条及配套的匀浆装置已经开始用于商业生产。Oem等人利用单克隆抗体（MAb 70-17）建立了一种快速检测口蹄疫病毒的横向流动免疫层析技术方法，该方法可以对O、A、Asia1和C型口蹄疫病毒进行检测，检出率可以高达87.3%，与酶联免疫吸附试验检出率几乎一致（87.7%）。检出特异性为98.8%，也与酶联免疫吸附试验方法基本一致（100%）。该方法可以迅速短时间内对待检样品进行检测，因此具有很重要的实际应用价值。杨苏珍等通过蛋白的表达、纯化和复性；多肽的合成和筛选，获得了能和O型口蹄疫病毒抗体特异性结合VP1蛋白和3条多肽，将VP1蛋白和合成肽分别作为免疫原和反应原成功制备3株特异性单克隆抗体；将金标BSA结合肽作为诊断抗原，以单抗IgG和SPA分别作为质控线和检测线，成功研制了O型口蹄疫病毒抗体快速检测免疫层析试纸条，不仅为基层养猪业提供一种快速、特异、敏感、简便的O型口蹄疫病毒抗体检测手段，还为动物疫病抗体水平监测建立了一种新型实用的方法。蒋韬等为建立一种快速、准确检测O型口蹄疫病毒抗原的胶体金免疫层析方法，将兔、豚鼠抗O型口蹄疫病毒多抗用DEAE-Sephose层析柱纯化。胶体金标记O型豚鼠口蹄病毒疫抗体，形成金标探针并将其喷涂于玻璃纤维上。兔抗O型口蹄疫病毒抗体和羊抗豚鼠IgG分别标记于硝酸纤维素膜上作为检测带和质控带，各部件按顺序装配形成快速诊断试纸条。如果待检样品中含有O型口蹄疫病毒，它将与玻璃纤维上的胶体金探针和兔抗O型口蹄疫病毒抗体形成夹心复合物，并在检测带被固定，沉集反应形成肉眼可见的红色条带。在田间试验中，53份试验样本分别用试纸条和反向间接血凝试验进行检测，2种方法的阳性率分别为95.45%和90.91%。评价试验证实，本研究建立的胶体金免疫层析方法简便、快速，具有良好的特异性和敏感性，非常适于基层兽医实验室诊断时使用。朱文钏等运用免疫胶体金技术，以纯化的重组3AB蛋白作为抗原，建立了口蹄疫3AB非结构蛋白抗体快速检测方法，包括斑点免疫金渗滤法和胶体金免疫层析试纸法。采用用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，用制备的胶体金标记葡萄球菌A蛋白（SPA），标记好的金标SPA经离心纯化后，用胶体金稀释液稀释至工作浓度。通过优化抗原包被浓度、封闭液和金标SPA工作浓度等建立了能够区分口蹄疫自然感染动物和免疫动物的斑点免疫金渗滤法和胶体金免疫层析试纸法。斑点法和试纸法检测口蹄疫3AB抗体具有操作简便、不需要特殊的实验环境及复杂的样品处理、检测时间短（2～5min）、结果显示直观等优点，在口蹄疫的快速诊断中具有重要的应用价值。吴磊等试图将口蹄疫病毒N端富积成簇的B细胞表位的2C蛋白与3AB蛋白构成2C′3AB发展胶体金检测试纸条。胶体金标记口蹄疫病毒非结构蛋白2C′3AB， 形成金标探针并将其喷涂于玻璃纤维上， 2C′3AB蛋白和兔抗2C′3AB多抗分别标记于NC膜上两个界定的区域，作为检测带和质控带。各部件按照顺序装配成快速诊断试纸条，检测阴性和阳性血清样本表明，该试制条灵敏度高，特异性强，重复性和稳定性好。与口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒符合率高，适用于口蹄疫感染和免疫鉴别诊断的快速检测。任维维等采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金。利用其对阴性参考样品、各型阳性参考样品、已知背景的田间样品进行检测。结果表明，所建立试纸条方法可检测到病毒最低含量为0.98×104半数致死量（LD50）。在检测与口蹄疫临床症状相似病原—猪水疱病病毒、水疱性口炎、水疱性疹抗原时无交叉反应；而且不同批次间、同一批次内检测结果完全一致。对已确定口蹄疫病毒阴阳性的90份样品检测结果表明，其阳性符合率、阴性符合率分别为96.70%、100%。林彤等为建立一种快速、简便、灵敏检测Asia1型口蹄疫病毒的胶体金免疫层析方法（GICA），亦采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记纯化的抗Asia1型口蹄疫病毒的单克隆抗体，将该标记物与羊抗豚鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜上，作为检测带和质控带。经条件优化，组装成检测Asia1型口蹄疫的诊断试纸条。用该试纸条分别对A、O、C和Asia1型口蹄疫病毒抗原以及猪水疱病病毒抗原等87份样品进行了检测，发现该试纸条不与口蹄疫病毒A、O、C型以及猪水疱病病毒抗原发生反应，特异性良好。该试纸条与其他传统诊断方法的符合率为98.8%。
2.新酶联免疫吸附试验方法
IZS公司开发了一个基于血清特异单克隆抗体的诊断酶联免疫吸附试验方法。在临床样本中，此方法依赖于口蹄疫病毒血清O、A和C型三种单克隆抗体混合物以鉴定口蹄疫病毒。口蹄疫病毒单克隆抗体限定了一个特殊区域，在一个实验中，一系列病毒可以被鉴定分析。在Ma等的实验室里面，他们获得了一株针对血清O型的单克隆抗体，此抗体准确覆盖了口蹄疫病毒VP1蛋白133～160的氨基酸。此方法基于抗原捕获酶联免疫吸附试验方法可以鉴定口蹄疫病毒血清O型，也可以区分血清A、C、Asia1型和猪水疱病。此合成方法有很大潜力制备针对构象决定簇的单克隆抗体。针对准确表位的单克隆抗体也可以用来开发特异性口蹄疫病毒野毒株的诊断试验。
3.口蹄疫病毒彩色微球分型试纸条诊断方法
彩色乳胶颗粒是近年来发展较快的免疫新技术，由于乳胶颗粒可以根据试验制备出诸如红、蓝、黄等多种颜色，将其作为标记物可实现对同一样本进行多重多元分析，满足口蹄疫多重血清型的检测需要。彩色胶乳标记技术是将不同直径范围彩色胶乳微球与含有羧基、氨基、羟基等基团结合，当此彩色胶标记物与相应配体结合后形成胶乳复合物，可显示出肉眼可见的不同颜色。利用免疫微球技术建立口蹄疫病毒O、Asia1型、A型多重分析乳胶微球层板方法，可为今后样本的高通量、多重分析奠定理论基础，同时为口蹄疫的快速诊断提供新的手段。蒋韬等采用2种不同颜色彩色单分散的微球，将纯化O型、Asia1型流行株兔抗体分别标记红色和蓝色免疫微球，并将2种免疫微球分别喷涂于玻璃纤维制成反应垫，与固定Asia1型和O型兔抗体的硝酸纤维素膜组装成检测试纸条。通过与田间样品的检测，结果显示：可检测病毒含量为3.9×104 LD50，与口蹄疫临床症状相似病原无交叉反应，试纸条指间与批内检测结果一致、符合性试验证实试纸条与反向间接血凝，O型、Asia1型阴性符合率分别为95.24%、96.30%、100%。本试验通过制备的口蹄疫病毒定型彩色微球检测试纸条具有较好的灵敏度、特异性，而且可以通过不同颜色进行口蹄疫分型检测，为口蹄疫病原的多重分析提供方向。
4.合成肽抗原在口蹄疫病毒中和抗体检测中的应用口蹄疫病毒抗原位点几乎全部集中在P1区，VP1、VP2、VP3位于抗原蛋白表面，VP4位于衣壳内部，4种结构蛋白都具有良好的免疫原性。对于O型口蹄疫，从病毒衣壳蛋白分离的VP1可诱导动物产生针对口蹄疫病毒的中和抗体，研究表明，VP1上的3个中和性抗原位点，21～40氨基酸为T细胞抗原表位，141～160氨基酸和200～213氨基酸为B细胞表位。因此，在对口蹄疫病毒抗原位点优化筛选的基础上，利用非蛋白多聚体定向偶联技术，将筛选合成好的口蹄疫合成肽偶联后作为抗原，建立了一种灵敏度高、特异性高、操作简单，并能快速检测口蹄疫病毒中和抗体的酶联免疫吸附试验检测试剂盒。陈善真等通过多肽序列的筛选、合成及反应原性鉴定，将多肽与非蛋白结构多聚体载体进行偶联，利用偶联后的多肽作为抗原，通过方阵滴定确定偶联多肽、血清及HRP的最佳工作尝试，确定阴阳性临界值，然后进行特异性试验、敏感度测定及临床猪血清样本的免疫效果评估等进行方法的确证。结果表明，偶联多肽具有良好的反应原性，且此方法特异性好，敏感度高，能够对口蹄疫免疫后的猪血清样本进行评估。本研究建立的O型猪口蹄疫病毒中和抗体检测试剂盒可以用于口蹄疫免疫后的猪血清中和抗体的监测评估，还能够鉴别口蹄疫自然感染与疫苗免疫。
5.区分自然感染和口蹄疫免疫动物的新技术
近年的研究发现，口蹄疫病毒的L蛋白、3A蛋白、3B蛋白以及VP1蛋白处可以插入外源基因或表位标签，从而为标记疫苗方面的应用提供有效的平台。L蛋白中最易发生变化的区间是两个AUG之间的区域。Piccone等研究表明AUG之间的区域可以插入57个碱基，利用反向遗传操作技术获得的重组毒株pA24-L1123在细胞上的复制水平比野毒稍低些。而且对牛的致病性有明显的减弱。在此基础上，Piccone又引入了两个表位标签（HA和Flag）和一段较小的tc基序。Li等选用3A蛋白的两个位点（85～92和133～143）分别作为不同外源标签的插入位点来研究口蹄疫病毒表位标签的能力。使用一段8个氨基酸的FLAG表位和11个氨基酸的HSV表位来分别替换3A蛋白原有的85～92和133～143的氨基酸序列，这并没有增长这一组的长度。利用反向遗传操作技术将FLAG和HSV标签分别引入到3A蛋白的85～92和133～143的位点，然后将构建的质粒转染到BSR/T7细胞系中拯救出了病毒，表明口蹄疫病毒3A蛋白允许外源表位引入到C端并维持口蹄疫病毒的复制功能。通过蛋白免疫印记和序列分析表明，3A蛋白标记的病毒在BHK-21细胞上连续传II代后仍可稳定表达外源表位，空斑和生长曲线结果表明重组毒和亲本毒具有相似性。将重组毒感染昆明小鼠四周后，发现接种标记3A蛋白病毒的小鼠能够诱导抗标签和抗3ABC抗体的产生，而感染亲本毒的小鼠产生了抗3ABC抗体。血清学结果显示3A标记的病毒能诱导特异性抗体应答反应以区分亲本毒产生的抗体应答。因此，3A标记的病毒可以作为允许在血清学水平上区分免疫接种与天然感染动物的市场化疫苗。2012年，Uddowla等构建的含有一个或二个部位的突变在3D聚合酶和3B非结构蛋白中形成阴性抗原标记，在3D H27Y、N31R和3BRQKP9-12-PVKV替代的突变株中止了单克隆抗体靶向3D和3B的反应，一种竞争酶联免疫吸附试验靶定阴性标记提供了一种适合同时区分感染和免疫的动物。Lawrence等在病毒衣壳上的RGD基序的上游序列插入了外源标签FLAG以区分野生型毒株和重组毒株，结果显示插入FLAG标签后的重组毒与野毒具有相似的复制水平，并且嵌入的FLAG标签可以使用抗FLAG抗体检测。而且，通过检测A24-FLAG免疫牛以后的临床样品，可以发现免疫后FLAG表位仍然存在。Seago等利用反向遗传技术在VP1与2A之间构建了表达荧光标记蛋白iLOV的重组口蹄疫病毒。对感染性重组iLOV-口蹄疫病毒生物学特性分析表明重组毒与亲本毒具有相似的生长特性，此外，通过流式细胞术可以很容易将感染重组毒iLOV-口蹄疫病毒的细胞与正常细胞区分。朱文钏等通过检测口蹄疫3AB非结构蛋白抗体建立一种能区分自然感染动物和免疫动物的检测方法。此试验将3AB基因克隆到原核表达载体pET-28（a）+中，通过优化表达条件，使目的蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中获得高效表达，表达产物主要以包涵体形式存在，分子量约为33ku，表达产物通过镍离子亲和层析柱进行纯化后得到纯度高达95%的目的蛋白，并将此蛋白作为抗原进行后续试验。以纯化的3AB蛋白作为抗原包被酶标板，建立了猪口蹄疫3AB非结构蛋白抗体间接ELISA检测方法。通过方阵法确定蛋白最佳包被浓度为0.625μg/毫升，最佳血清稀释度为1：100，羊抗猪酶标二抗最佳工作浓度为1：25000。优化了反应体系中的封闭液、稀释液，并确定了血清、二抗及底物的最佳作用时间。通过参照进口试剂盒判断标准，确定了本方法的判定标准。本试验建立的方法在特异性、重复性、稳定性等方面都取得了较满意的效果。
（张向乐、张志东）
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