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非洲猪瘟实验室检测技术研究进展
现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2019/9/29 19:07:48 关注：661 评论： 我要投稿
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非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起猪的一种烈性传染病。我国将其列为一类传染病，世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物传染病。1921年首先在肯尼亚记载了该病的暴发，随后相继传入欧洲和南美洲，2007年传入了高加索地区，给当地养猪业和经济造成了较大的影响。2018年8月在我国辽宁沈阳报道了首例非洲猪瘟疫情，随后在我国大多数省份相继发生了非洲猪瘟疫情。由于非洲猪瘟病毒是唯一的昆虫源性DNA病毒，目前尚无有效的疫苗用于非洲猪瘟的预防，防控主要是通过扑杀感染区的猪只来根除疫情，一旦发生疫情将对养猪业造成毁灭性的打击，给肉食品的供应造成严重的影响。所以对于非洲猪瘟的防控措施，“早、快、严、小”显得尤为重要，非洲猪瘟的诊断首先要根据流行病学、临床症状和病理变化等方面作出初步判断，再根据实验室检测结果进行确诊，实验室诊断的原则是快速、准确。近年来，分子生物学检测技术在动物疫病诊断方面得到了广泛的应用，下面将对非洲猪瘟的实验室检测技术进行综述，为非洲猪瘟防控提供参考。
1病原检测
1.1病毒分离鉴定
病毒分离鉴定是ASF诊断的经典方法，将临床怀疑的样品接种于易感的细胞和猪体内，获得病毒的增殖，然后对分离的毒株进行鉴定。病毒分离鉴定在流行病学溯源、病原检测、生物学特性、致病性和疫苗毒株的研究中具有重要的作用。1951年南非分离的Spencer株是通过猪体内传代11次得到的，另外采用猪-兔交替接种也可以培育出ASFV的兔适应株。1960年，Malmquist等首次用猪骨髓细胞和血液白细胞成功分离到ASFV，随后该技术广泛应用于ASFV的分离。目前，用于ASFV分离的细胞分为原代细胞和传代细胞。
1.2红细胞吸附试验(HAD)
1960年，Malmquist在首先发现了病毒感染猪白细胞的培养物后出现了红细胞吸附的反应，从而建立了ASFV的HAD试验方法，后经过完善成为了ASFV的鉴定方法。ASFV的红细胞吸附能力通过抗血清阻断，且抗体的抑制作用只针对同源毒株，因此可以用来测定抗体的效价和鉴定抗原的差异。大多数ASFV的分离株具有HAD的活性，但也存在少数的毒株没有此活性，称为NHV（non-haemadsorbing virus）毒株，该类毒株大多数不具有致病性。1963年首先在西班牙发现NHV毒株，这些毒株能在白细胞培养中产生细胞病变，但没有HAD能力。对于该类毒株可用FAT或PCR进一步鉴定。HAD试验是OIE推荐的病毒鉴定方法之一，敏感度大约为92%，由于NHV株的存在，并不适用于所有ASFV的检测，试验时间需要3-10d，目前该方法逐渐被PCR方法所替代。
1.3荧光抗体试验（FAT）
1969年，Bool等首先建立了ASFV的FAT试验方法，该试验方法广泛应用于病毒抗原的检测。1985年，随着ASFV单抗的研制成功，利用荧光标记单抗用于分离病毒和组织的检测，特异性更高。FAT方法可用于白细胞培养物涂片进行抗原检测，也可以用于感染猪的淋巴结、脾、肾和肺等组织进行冰冻切片或压片，观察到细胞浆荧光判为病毒阳性。该试验是OIE推荐用于ASFV抗原鉴定的方法，不仅可用于NHV毒株的检测，还可用于其他致病CPE病毒的鉴别诊断。在急性病例的检测中，FAT方法敏感性高、快速、经济，可以在2h内获得结果，但在亚急性、慢性的病例的诊断中敏感性显著降低，原因可能是组织体内抗体与靶抗体形成复合物，阻断了靶抗原与荧光抗体的结合。
1.4病毒核酸检测
1.4.1普通PCR方法
PCR技术发明于上世纪80年代，利用特异性的引物，对样品中的核酸模板得到指数级别的扩增，使皮克（pg）水平的DNA扩增到微克（μg）水平，扩增产物通过染色得于用肉眼识别，大大提高了检出率。1992年，Steiger Y等根据保守基因设计了特异的引物用于ASFV的检测。进入21世纪，PCR技术得到了进一步的发展，检测的特异性和敏感性得到了进一步的提高。ASFV的PCR引物通常是根据B646L基因的高度保守区来设计的，引物的位置不同和碱基的组成不同，PCR的扩增效率也不同。OIE推荐的PCR方法是Aguero等2003年建立的，扩增片段大小为257bp，该方法用于检测不同区域，不同年代的22株ASFV毒株均为阳性，最早可以检出感染2d猪的血液样品为阳性。Basto等根据B646L基因设计了2对引物建立了ASFV巢式PCR方法，内引物扩增片段为243bp，外引物扩增片段为370bp，该方法不仅可以检测组织、血液样品和培养物，还可以检测昆虫软蜱体内所带的ASFV。2008年，Giammarioli等建立ASFV、CSFV、PCV-2、PRRS和PPV等5种病毒的多重PCR，用于上述5种病毒的鉴别诊断，其中ASFV的引物为OIE推荐的引物。PCR方法快速、灵敏已经广泛用于ASFV的实验室诊断，但由于PCR需要对扩增产物进行分析，需要开盖，容易造成交叉污染，容易造成假阳性，另外临床样品中可能存在的酶抑制剂扩增不出造成假阴性。
1.4.2荧光PCR方法
荧光PCR方法是1996年由美国AB公司推出，实现了PCR检测技术由定性向定量的发展。2003年，King等建立的ASF的TaqMan探针荧光PCR方法，该方法是OIE推荐的方法，引物和探针均是根据B646L基因的高度保守区设计，灵敏度比OIE推荐的PCR方法提高10～1000倍。我国董志珍等根据E183L基因设计了引物和探针，建立了ASFV荧光PCR方法，可检出低于15 copies/μL的病毒样品，并获得国家专利。Zask L等建立了TaqMan探针荧光PCR方法，检测临床168份样品，特异性为100%，准确性92.8%～96.4%。王建华等[7]根据ASFV 的CP530R 基因、CSFV 5'UTR 基因和HP-PRRSV NSP2 基因，分别设计了3对特异性引物和TaqMan探针，建立了检测3种病毒的荧光PCR方法对特异性引物和TaqMan 水解探针,可以检出ASFV低于61copies/μL的质粒。目前，荧光PCR方法已广泛应于ASFV的检测，可以在1h内完成检测，在市场上具有成熟的商品化试剂盒，在临床样品的快速检测中起到较大的作用。也有部分试剂盒不用核酸提取，直接扩增，但对样品类型要求较高，敏感性也受影响。荧光PCR方法与PCR方法相比，具有特异性更强、灵敏度更高、重复性好反应更快，自动化程度更高，另外荧光PCR方法不用开盖，解决了PCR方法的污染问题。荧光PCR方法的缺点就是需要使用荧光PCR仪，比较昂贵，检测区域需要PCR分区。
1.4.3数字PCR方法（ddPCR）
数字PCR (Droplet digital PCR，ddPCR)，是近年来兴起的一种新的绝对定量PCR技术，通过极度稀释实现理论上的单分子扩增，然后用终点法PCR和泊松分布计算出样品的原始浓度。邬旭龙等根据ASFV 的K205R 基因序列设计了1对特异性的引物和TaqMan探针建立了ASFV的ddPCR方法，最低检测限度可达到0.36copies/μL，在20μL反应体系中约为10copies/μL，检测灵敏度是荧光PCR方法的10倍。数字PCR相比于PCR和荧光PCR，敏感性更强，特异性更高，可以做到病毒含量的绝对定量，在机体低浓度病毒含量的早期感染或潜伏感染的诊断中更加具有潜力，但该方法需要使用昂贵的仪器设备和试剂的成本较高，不适合大规模样品的检测。
1.4.4环介导等温扩增技术（LAMP）
LAMP方法是采用独特的引物设计，利用一种链置换DNA聚合酶，实现等温条件下的高效扩增。2009年，江彦增等根据OIE推荐引物，建立了ASFV的LAMP方法,该方法的敏感性是OIE推荐PCR方法的100倍。2017年，田纯见等根据高度保守的非结构DNA聚合酶G1211R基因，制备质粒标准品，建立实时荧光LAMP方法, 以ASFV的E70毒株病毒核酸为模板，LAMP检测灵敏度达到21pg，优于荧光定量PCR方法,重复性试验LAMP检测批内和批间变异系数均小于5%。LAMP检测方法的优势就是快速、敏感，可以在30min内完成检测，操作简单，并且不需要特殊的仪器设备，该方法更适合用于田间的快速检测，在基层如屠宰场、养殖场更具有广阔的应用前景。但由于LAMP方法具有较高的敏感性，容易出现交叉污染，出现假阳性。
1.4.5重组酶聚合酶扩增(RPA)
RPA方法是一种等温基因扩增技术,模拟了体内的DNA复制。结合单链核酸（寡核苷酸引物）的重组酶、单链DNA 结合蛋白（SSB）和链置换DNA 聚合酶3种酶的混合物在常温下即具有活性，反应温度介于37～42℃，可以30min内使目的基因得到指数级增长，采用荧光探针标记，使用荧光信号检测仪，可实现对扩增的实时监控。2016年，王建昌等[11]根据ASFV的P72基因保守序列设计引物，建立了ASFV的RPA方法，该方法的检测限达到100copies/μL，与OIE推荐的荧光PCR方法检测限一致。2017年，李林等根据ASFV的B646L基因保守区设计并合成了特异性引物和exo探针,建立了ASFV的RPA方法，该方法可在20min内完成检测，最低可检测到16copies/μL，与荧光PCR方法具有相似的灵敏度和特异性。采用快速的核酸纯化方法和便携式的荧光信号检测仪，具有快速、特异和操作简单等优点适合基层田间包括养殖场、屠宰场和流通环节的快速检测，在现阶段对于我国防控非洲猪瘟具有重要的意义。
1.5胶体金免疫层析法
胶体金免疫层析法是采用胶体金标记技术，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，近年来应用于各种动物疫病抗原和抗体的快速检测。2018年，吴海涛等[13]以原核表达的ASFV的PET-30A-P72蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔制备血清，以ASFV单克隆抗体杂交瘤细胞株接种到小鼠腹腔内制备腹水，通过纯化获得ASFV的单克隆抗体和多克隆抗体，建立了ASFV胶体金免疫层析法，经测试该试纸条的特异性、敏感性和稳定性表现良好。胶体金免疫层析法操作简单、快速，可以10min内完成检测，不需要仪器读数。根据比对的结果由于该方法的敏感性较差，对于ASFV的检测可能会存在假阴性结果。由于该方法的局限性，当前仅适用于病死猪的ASFV检测。近年来，在胶体金免疫层析技术的基础上开发出了ASFV的荧光免疫层析技术，内含有大量荧光报告分子，荧光信号强而稳定，不受溶剂的影响，具有极强的抗光漂白能力，采用手持式荧光仪读取数值，人为因素影响小，敏感性比胶体金免疫层析技术提高了约100倍。
2血清抗体检测
2.1酶联免疫吸附试验（ELISA）
ELISA方法是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的技术，是目前血清检测最常用的方法。1990年，Pastor等将经过处理后获得CS-P为包被抗原，建立了间接ELISA抗体检测方法,首次检测到抗体的时间为感染后7d，适用于ASFV感染的早期检测，该方法也是OIE推荐的方法。2012年，董志珍等利用基因重组技术制备的非洲猪瘟蛋白P54免疫小鼠获得单克隆抗体，使用该单克隆抗体，建立了检测血清中非洲猪瘟抗体的竞争法ELISA，建立的ELISA竞争法特异性高，无交叉反应，灵敏度高于间接免疫荧光法。2016年，曹琛福利用原核表达系统表达的重组P54蛋白，建立了ASFV抗体竞争ELISA方法，该方法特异性强，达到100%，灵敏度高，可达96.22%；与西班牙INGENASA公司生产的检测非洲猪瘟竞争ELISA试剂盒的符合率可达到98.13%。由于ASF尚无疫苗，ELISA方法不仅适用于大规模的血清学筛查，对于单个阳性血清样品敏感性也较高，已经广泛应用于ASF的流行病学监测和根除计划。目前，用于ASFV抗体检测的有间接ELISA和阻断ELISA，并且有特异性和敏感性高的成熟试剂盒。
2.2间接免疫荧光试验（IIF）
1970年，Sanchez等首先建立了ASFV 抗体的IIF检测技术，IIF敏感性高，检测时间短，当ELISA检测结果不确定或制备抗原困难复杂时，可以使用此方法。但由于在反应中受多种因素的影响，容易产生非特性的染色，影响结果的判断。
2.3胶体金免疫层析技术
2017年,林彦星等根据ASFV的VP73蛋白，合成多肽并与牛血清白蛋白（BSA）偶联，筛选出有抗原性的多肽作为试纸条检测线的包被抗原，制备出快速检测ASFV 抗体的胶体金免疫层析试纸条。所制备的试纸条特异性强、敏感性高、稳定性好和操作简便，与ELIA检测结果的符合率达到100%，可用于ASFV 抗体的快速检测和流行病学调查。
3展望
ASF的诊断应根据流行病学、临床症状和病理特点作出初步判断，再根据实验室诊断结果进行确诊。ASF的早期诊断和确诊都要依赖于实验室的结果。当前，我国正处在防控ASF的关键时期，农业农村部要求屠宰场、猪肉加工企业加强非洲猪瘟的自检，职能部门加强监督抽检，确保猪和猪肉产品的质量安全，各级的实验室要根据实际情况，选择适合检测方法，做到快速、准确和简便，做到早发现、早处理，防止疫情的扩散。
参考文献略
作者：东莞市动物疫病预防控制中心，张险朋
来源：《动物防疫一线》2019年第4期
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| 文章来源：动物防疫一线 文章作者：东莞市动物疫病预防控制中心，张险朋 文章编辑：一米优讯 |
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