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猪瘟诊断技术大全


现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2019/10/14 11:04:30 关注:73 评论: 我要投稿

关键词:猪瘟 诊断 技术 大全
  猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种高度接触性病毒性传染病,被农业部列为一类传染病。CSF流行广泛,且发病率及死亡率高,给我国及世界养猪业造成了巨大经济损失。临床可分为急性型、慢性型、非典型、以及出血性败血症型。近年来,CSF症状已由典型逐渐转为非典型,隐性感染,持续感染,临床症状非常不明显,往往导致无法解释免疫失败现象,给CSF的诊断带来了很大困难。因此,强化CSF诊断方法的研究势在必行。数十年来,各国学者倾力研究,促进了CSF的诊断方法日趋完善,为CSF的控制和净化提供了良好的工具。
  一、抗原检测方法
  (1)病毒分离鉴定
  此法最经典, 最可靠。取可疑病猪的扁桃体、淋巴结、脾或肾组织病料混合,加双抗后磨成2%~10%乳剂,离心后取上清、过滤除菌后或采集早期发病猪全血样品(用肝素或EDTA处理)37℃水浴融化后,接毒于带细胞片的PK-l5细胞中,用CSF免疫荧光抗体法或免疫酶染色法检查细胞培养中盖玻片上细胞浆内的病毒抗原,此方法具有较高的敏感性。
  (2)动物接种试验
  用易感仔猪(10~20kg)接种可疑猪病料乳剂或新鲜血液。如果猪在接种后1周左右发病,可采血分离病毒。如果3周左右发病,可采血检测CSFV特异性中和抗体,并用CSFV强毒进行攻击。如果分离到CSFV或接种产生CSFV特异性中和抗体,并对CSFV强毒攻击呈现免疫性,即可判为CSF阳性。另外用CSF高免血清(l mL/kg)皮下注射试验猪 1 头,然后接种待检病料,另 1 头猪只注射待检病料,前者不发病,后者发病,即可判为CSF阳性。
  (3)免疫荧光试验
  组织直接免疫荧光试验:制备冰冻切片或抹片, 室温下丙酮固定10 min并风干, PBS冲洗,抗体孵育,再用PBS冲洗,荧光显微镜下观察组织片的荧光染色结果。该方法优点:不需采集病变实质组织,操作简单。缺点:主观性强,需有经验的荧光显微镜观察人员才能确诊。
  间接免疫荧光试验:提取抗原滴加1:4抗CSFV阳性血清,作用30min后洗涤,再加羊抗猪IgG荧光抗体,作用30 min后,漂洗、干燥、镜检。其优点:操作简便,诊断迅速;缺点:费用昂贵(配备荧光显微镜),特异性差,主观性强,需有经验的检验员,特别是诊断中强毒。
  (4)酶联吸附免疫试验
  酶联吸附免疫试验(ELISA)丘惠深等(1991)建立区分CSFV强弱毒的单克隆试剂盒。Leforban等(1990)报道用封闭ELISA法区分黄病毒中CSFV的抗体。Moennig等(1990)报道建立双夹心ELISA,将猪瘟单抗HCTC26包被到聚乙烯板上,然后固定CSFV gp53作为诊断抗原,然后检测血清抗体,此法测得抗体滴度高于病毒中和试验。优点:敏感性高,可大批量检测。缺点:非特异性强,各试剂盒标准不一致,相关性差。
  (5)分子生物学诊断
  随着科学技术的发展,分子生物学技术在诊断猪瘟方面的作用越来越大,并显示出强大的生命力,成为在诊断猪瘟方法上最准确最可靠的方法也是最有发展前途的诊断技术。
  1)反转录多聚酶链式反应(RT-PCR) 技术
  用RT-PCR技术能快速检测感染组织中的猪瘟病毒。但只能诊断出检测猪是否感染CSFV,不能区分是野生强毒或是疫苗毒。有研究人员采用RT-PCR结合其他方法来区分猪感染CSFV是野生强毒或是疫苗毒。如赵耘,秦玉明等用RT-PCR结合酶切方法来区分猪瘟疫苗毒和野毒。。
  2)荧光定量PCR
  荧光定量PCR技术融合了PCR 高灵敏性、DNA 杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点,直接探测PCR 过程中荧光信号的变化,以获得特定区段扩增产物定量的结果,不需要PCR 后处理或电泳检测,完全闭管操作(整个过程中仅有加入样品的一次开盖),一举克服了常规PCR 技术的诸多难题。
  3)环介导等温扩增技术
  环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)最早由日本Notomi 等(2000)报道,其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下,60-65℃恒温扩增,15-60分钟左右即可实现109~1010倍的核酸扩增,具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。在DNA合成时,从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应,产生大量焦磷酸镁沉淀,呈现白色。因此,可以把浑浊度作为反应的指标,只用肉眼观察白色浑浊沉淀,就能鉴定扩增与否,而不需要繁琐的电泳和紫外观察。由于环介导等温扩增反应不需要PCR仪和昂贵的试剂,有着广泛的应用前景。与其它的分子生物学方法相比,LAMP 有更方便、更简捷、更灵敏等优点。
  二、抗体检测方法
  (1)正向间接血凝试验检测猪瘟血清
  正向间接血凝试验是利用CSFV致敏红细胞, 将待检血清梯度稀释后进行抗原抗体反应, 根据红细胞的凝集判断结果。这种方法能够测出猪瘟抗体效价,简便易操作,常用于免疫抗体的监测。
  (2)酶联免疫吸附试验( ELISA)
  ELISA 免疫检测技术应用很广, 发展很快, 是检测抗体的主要免疫学方法, 也是监测猪群抗体水平的主要技术手段, 常用于规模化养猪场的监测。主要包括间接ELISA、Dot- ELISA、微波快速ELISA、竞争ELISA 以及抗原捕获ELISA等。
  (3)中和试验
  病毒或毒素与相应的抗体结合后,失去对易感动物的致病力,谓之中和试验。中和试验主要用于:1) 从待检血清中检出抗体,或从病料中检出病毒,用于诊断病毒性传染病;2)用抗毒素血清检查材料中的毒素或鉴定细菌的毒素类型;3)测定抗病毒血清或抗毒素效价;4) 新分离病毒的鉴定和分型,中和试验不仅可在易感的实验动物体内进行,亦可在细胞培养上或鸡胚上进行。包括兔体中和试验、荧光抗体病毒中和试验( FAVN)、过氧化物酶联中和试验(NPLA)。
  (4)免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)
  通过将二抗用HRP进行标记,标记后的二抗既具有与血清中的一抗特异性结合,又具有酶的活性。当二抗与一抗孵育之后,加入酶的底物后,二抗上标记的酶会与加入的底物发生反应并产生肉眼可识别的颜色。在光学显微镜下即可观察到并判定结果。IPMA至今仍是欧洲常用的检测手段,它具有较高的敏感性、特异性。
  (5)免疫胶体金技术
  免疫金银染色技术具有灵敏度高, 简便易行, 试剂价廉无毒、样品可较长期保存等优点。该方法最大的特点是简单快速、特异灵敏, 不需要辅助仪器和辅助试剂, 几分钟内就可用肉眼观察到试验结果, 并可长期保存试验结果。胶体金免疫层析技术现在己经成为当今最快速敏感的免疫学检测技术之一, 其可分为:液相免疫测定、金标记流式细胞术、胶体金固相免疫测定法。陈龙宾等建立了猪瘟胶体金免疫层析快速诊断方法,用胶体金免疫层析试纸条检测猪瘟病毒操作简便,需时短,可以用于猪瘟的流行病学调查。
  (6)金标卡诊断
  标卡能对猪瘟抗原或抗体进行快速诊断,该试剂卡在使用过程中操作简便,反应时间短,一般20 min 可得结果。此方法的优点是能进行活体检测。
  三、总结
  现今,进行猪瘟诊断的方法较多,但现有的猪瘟检测技术均存在着各自的优势和不足,适用于现地群体检测的方法虽然便捷,快速,但大多存在非特异性强,判断标准模糊等缺点。使用实验室诊断技术更加准确,但其中一些试验技术对仪器及技术人员要求很高。因此,发展更适用于现地检测,操作快捷简便,敏感性高,特异性强的抗原和抗体诊断方法以及各方法之间的相关性研究是今后的研究趋势。
文章来源:哈兽维科     文章作者:牟迪     文章编辑:一米优讯     
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