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禽流感难以确诊怎么办?你需要了解禽流感诊断技术


现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2019/11/14 11:16:00 关注:103 评论: 我要投稿

  禽流感病毒(Avian Influenza Virus)属于正粘病毒科流感病毒属,分为A、B、C三个型,其中A型流感病毒感染的范围最广,危害最大,它可以感染人、猪、马、哺乳动物、禽类等,是人和畜禽呼吸道疾病的重要病原。由禽流感病毒感染的家禽,其临诊症状及剖检的病理变化通常会因感染病毒毒株及特点有所差异,临诊上难以确诊,因此,为了有效的对禽流感病毒进行监测,及时发现流行的毒株进而控制该病毒的传播,我国动物流感研究中心建立了不同的禽流感病毒诊断技术,以满足我国禽流感流行病学监测及现地诊断与防制的迫切需要。


  禽流感病毒分子结构图


  一禽流感样本的采集
  对于来自活禽的样本主要采集泄殖腔和喉气管拭子,研究表明,泄殖腔和喉气管拭子样品对于检测禽流感病毒结果准确。将棉拭子插入泄殖腔1.5cm~2.0cm处,旋转后沾上粪便获得泄殖腔拭子样品;将棉拭子插入口腔至咽的后部直达喉气管,轻轻擦拭并慢慢旋转沾上气管分泌物从而获得喉气管拭子样品。对于病死禽类主要采集其组织样品,每只禽分别采集肠管及肠内容物各1份;肺和气管样品各1份;肝、脾、肾、脑等各1份,做好标记。采集的病原检测样品应保存于含有抗生素的PBS缓冲液中,加入抗生素的主要目的是用于消除任何可能干扰后续诊断的细菌。此外,从采集样品开始,现场样本应始终严格保持在低温条件下,切忌频繁的反复冻融,如果采集到的样品不能在短期内进行检测,建议将所有样品应保存在-80℃冰箱内。
  二禽流感病毒的分离培养
  流感病毒于1933年被科研人员将样品接种到10~12胚龄的鸡胚羊膜腔中,首次成功分离,证实鸡胚中的羊膜腔和尿囊腔的细胞非常适合流感病毒的增殖,这种使用SPF鸡胚分离禽流感病毒的方法,不仅是诊断AIV的金标准技术,而且是可以经过鸡胚接种产生高滴度的禽流感病毒的方法。样品接种SPF鸡胚后,如果没有血凝价,可将收集的尿囊液连续盲传三代后重新检测血凝价后,若仍无血凝价,则可以确定该样品不含禽流感病毒。如果有疑似HPAI的样品,则必须在生物安全三级实验室内进行操作。
  19世纪40年代有学者使用细胞进行了流感病毒的分离培养,为在鸡胚中不能很好生长的人或猪流感病毒提供了可行的分离培养方法,该方法可培养并扩增病毒,所以这种方法比直接检测更灵敏,但该方法需要将样品快速地运输到实验室,因为延迟可能导致病毒失活,从而不能做到从任何感染物上分离到病毒。
  三禽流感病毒的分子生物学检测技术
  目前禽流感的分子生物学检测技术主要有RT-PCR技术、荧光定量RT-PCR技术、核酸依赖的扩增技术(NASBA)、基因芯片技术以及LAMP技术等。
  1.RT-PCR技术
  RT-PCR技术从基因水平检测禽流感病毒,具备高度敏感性和特异性。目前应用RT-PCR方法对流感病毒进行诊断的报道很多,根据细节不同分出多种RT-PCR技术,常见的有常规RT-PCR、巢式RT-PCR (nested RT-PCR)、多元PCR (multiplex PCR )等。现在仍以常规RT-PCR 应用较为广泛,此方法可以利用基因扩增的方法直接检出病毒的基因,较病毒分离快。
  2.荧光定量RT-PCR检测技术
  通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。是近年来应用较多的分子生物学检测技术,该方法灵敏、快速,可对禽流感病毒的亚型进行区分,目前已经在省级以上动物疫病诊断机构广泛使用。
  3.依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)
  NASBA技术是一项以RNA为模板的快速等温扩增技术,这项技术特别适用于RNA分子的检测。这个检测方法灵敏度高、特异性强、易于操作,而且在检测过程中与系统发育学或临床相关的病毒无交叉反应能力,为确定疫情和采取防范措施争取了宝贵时间。
  4.基因芯片技术
  由于流感病毒拥有众多的型和亚型,无论是现存的哪一种诊断方法都无法同时对所有的流感病毒进行精确的分型。基因芯片技术可以对成千上万个基因进行检测,它的出现为同时对流感病毒进行检测和分型提供了可能的途径。禽流感基因芯片技术是一种比较系统、完善的检测技术,该方法的建立不仅有助于禽流感疫情各种亚型的有效监控,而且可以在第一时间内准确的发现新变异或基因重排的新亚型病毒,为应对新疫情暴发提供可靠的技术储备。
  5.LAMP技术
  是分子检测技术的又一突破,该方法通过两对引物,利用Bst DNA聚合酶的链置换活性提供反应的动力,在恒温条件下完成对核酸的扩增反应。该技术于恒温条件下几十分钟内即可完成,无需昂贵的仪器设备,结果可肉眼直接观察,具有简便、快速、灵敏度高、特异性好等特点,非常适用于基层实验室及大型养殖场的检测。近年来,已有一些成功应用该技术对病原体进行检测的文献报道。
  四禽流感血清学检测技术
  在诊断禽类AIV过程中,血清学诊断方法不仅在监测种群的疫病上发挥着重要的作用,同时也为禽流感病毒感染的诊断提供了一个精确的方法。常用的AIV血清学检测方法包括:血凝和血凝抑制试验、神经氨酸酶抑制试验、病毒中和试验、酶联免疫吸附试验、琼脂凝胶扩散试验、间接免疫荧光试验等。
  (1)血凝和血凝抑制试验(HA/HI):其原理是依据流感病毒表面的HA蛋白可与含有唾液酸的糖蛋白结合,它们之间的结合比较紧密,不经特殊处理,难以分开,这种凝集是不可逆转的。但该凝集可被相应的特异性抗体所抑制,因此血凝试验通常用来进行禽流感病毒的初步检测,检测时间应控制在30min以内,否则易出现假阳性结果。一旦血凝试验呈阳性结果,需要进一步考虑用特异性血清做血凝抑制试验,与新城疫等有血凝活性的病原进行鉴别。
  (2)神经氨酸酶抑制试验(NI):是鉴定AIV NA亚型的主要手段,其不会受到血清中非特异性因素的干扰,有较高准确度,但需要注意,某些NA亚型之间可能会出现交叉反应,HA的抗体也可能对NA产生影响。
  (3)酶联免疫吸附试验(ELISA):该方法是以抗原或抗体固相化以及酶标记技术为基础的,抗原或抗体能在固相载体表面结合且保持原有的免疫学特性,经酶标记后的抗原或抗体复合物既保留了免疫学特性,又具备酶的活性。抗体结合显色后利用酶标仪读取结果,进行判定。ELISA检测方法多种多样,常见的有间接ELISA、竞争ELISA、DOT-ELISA等,该检测技术具有较好的敏感性和特异性,既可以检测抗原又可以检测抗体,是一种快速的临诊诊断方法。
  (4)病毒中和试验(NT):该方法是较为经典的血清学检测手段,特异性、敏感性都比较好,同时可以测量动物体内中和抗体含量,但由于操作较繁琐、耗时,当涉及到具有感染性病毒时需要在生物安全级别较高的实验室操作,这使得该方法几乎不应用于临诊快速诊断。
  (5)琼脂凝胶扩散试验(AGP):根据免疫沉淀原理,抗原和抗体可以通过悬浮的间质扩散到反应区域,当抗原抗体发生反应时,就会在琼脂糖介质上产生一条白色沉淀线。该方法操作简便、特异性较高,但是敏感性较低,对抗原抗体要求高,病毒必须经过裂解,故其已经很少使用。
  (6)间接免疫荧光试验(IFA):该方法使用标记有荧光素的抗原或抗体进行反应来对流感病毒进行鉴定,具有简便易操作、敏感、低费用等特点。
  来源:哈兽维科
  作者:田丽娜

文章来源:哈兽维科     文章作者:田丽娜     文章编辑:一米优讯     
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