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ELISA在兽药残留检测中的应用


现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2012/4/1 22:06:50 关注:451 评论: 我要投稿

新希望六和——生物环保饲料

  兽药残留分析技术是复杂混合物中的痕量分析技术,现代方法通常包括样品的前处理(提取、净化、浓缩和衍生化)和 测定两部分。最初,残留分析技术极限于化学分析法、比色法和微生物法。化学分析法和比色法缺乏专一性和敏感性,而微生物法虽然普通适用于抗菌药物的残留测定,但不易筛选到特别敏感的菌株,方法常受到其他抗菌药物的影响。薄层色谱(TLC)操作简单,结果可靠,但乃需要复杂的样品前处理,灵敏度不高。20世纪60年代后的GC 和七八十年代后的质谱(MS)、HPLC以及GC-MS、LC-MS等联用技术的飞速发展大大地提高了分析的灵敏度和分辨率,拓宽了残留分析范围。HPLC和GC等方法较之微生物法有高度的灵敏度和特异性,但设备昂贵,对实验人员也有较高的要求,分析费时而不易推广。同时它还需要复杂烦琐的样品前处理且不能同时筛选大量的样品,这对药物残留的及时监控无疑是不合适的。20世纪90年代后,免疫检测技术飞速发展,大大推动了兽药残留检测技术发展的进程,一系列免疫检测试剂盒的生产与应用加快了兽药残留分析的标准化。目前普遍应用于兽药残留分析的是酶免疫检测法,其研究过程一般包括人工抗原的合成、抗体的制备以及检测方法的建立等步骤。但绝大多数药物是小分子物质,分子量小于1KDa,没有免疫原性,必须把它交联到大分子蛋白质上制备人工抗原来获得免疫原性。因此兽药的免疫检测有其自身的特点。单克隆抗体在灵敏度和交叉反应方面都优于多克隆抗体,且具有均一性、专一性和无限量供应性等特点,有利于标准化。

  内酰胺类

  Rose等用头孢噻呋的水解产物去呋喃羰基头孢噻呋作为半抗原,将其原位交联到载体蛋白BSA和KLH上制备了两种人工抗原,免疫BALB/c小鼠后最终筛选出两株单克隆抗体,cef-68和cef-116,并以之建立了检测头孢噻呋的Ci-ELISA方法,cef-68和cef-116的IC50分别为32ug/kg和0.33ug/kg,,其检测限分别为32ug/kg和0.33ug/kg。单克隆抗体对头孢噻呋有较高的选择性,交叉反应的数据表明只有少数头孢菌素与之有交叉反应,而青霉素则与之没有交叉反应。

  氟喹诺酮类

  Holtzapple等先将载体蛋白BSA、卵清蛋白OVA用过量的乙二胺处理后碳二亚胺法合成了cOVA-Sara和cBSA-Sara两种沙丁沙星人工抗原。以cBSA-Sara免疫BALB/c小鼠,

  用cOVA-Sara作包被原筛选出了6株单克隆抗体,并以之建立了检测沙丁沙星的Ci-ELISA方法。标准曲线的IC50范围为7.3-48.3ug/kg,批内相对标准偏差11.0%(n=3),批间相对标准偏差10.8%(n=3),检测限为2 ug/kg。组织样品在10 ug/kg 、50 ug/kg、100 ug/kg的添加水平下回收率分别为132%、78%和81%。交叉反应数据表明单抗对沙丁沙星有很高的选择性。

  Duan等制备了环丙沙星多克隆抗体,并建立了检测环丙沙星残留的Ci-ELISA方法,检测限为0.32ng/mL标准曲线0.32ng/mL-5000 ng/mL范围内线性关系良好,批内和批间相对标准偏差分别为5.81%和11.23%。环丙沙星在猪肉、鸡肉及牛乳中的回收率分别为75.58%、81.2%和84.5%。抗血清与思诺沙星的交叉反应率为69.8%,与金霉素、庆大霉素、青霉素、新霉素、喹乙醇和磺胺等无交叉反应。蔡勤仁等制备了恩诺沙星单克隆抗体,Ci-ELISA的最低检测限为0.13ng/mL。

  磺胺类

  李喜旺等制备了6种模拟磺胺类药物母核结构的人工抗原和3种多克隆抗体,并对抗体的选择性与亲和性,免疫原与靶物质的免疫相关性和免疫反应条件进行了探讨。部分抗体对?试的9种磺胺类药物显示了高度的选择性和亲和性,其中7种药物Ci-ELISA抑制曲线,检测限低于0.01 ug/mL,并在PH=4.4-5.4的介质中亲和性最强。Sheth等制备了多种模拟磺胺类药物母核结构的人工抗原和多克隆抗体,并以建立了检测磺胺类药物的Ci-ELISA方法。

文章编辑:现代畜牧网     
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