评估霉菌毒素脱毒产品的体外方法

现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2020/6/1 10:58:27 关注：1094 评论： 我要投稿

  评估霉菌毒素脱毒产品的体外方法
  刘云福 译 张配配 校

  摘  要：霉菌毒素污染饲料是一个世界性的安全问题，给全球各地的经济造成了巨大损失。本文简要介绍了减少霉菌毒素污染的可行性产品以及体内和体外检测方法。
  关键词：霉菌毒素；吸附剂；生物转化脱毒剂；胃肠道模型霉菌毒素污染饲料是一个世界性的安全问题，给全球各地的经济造成了巨大损失。
  霉菌毒素是霉菌产生的一类稳定的小分子次级代谢产物，一旦生成极难被清除。人或动物采食被霉菌毒素污染的食物或日粮后健康会受到不良的影响，可出现畸形、癌症、雌激素样刺激或者免疫抑制。
  用物理或化学方法处理霉菌毒素通常会影响饲料的营养价值。这也是为什么生物学方法通常被认为是减少动物摄入霉菌毒素的最可靠方法。
  1  降低霉菌毒素污染的可行性
  在饲料中添加脱毒剂的目的是降低霉菌毒素的生物利用率，从而减少动物摄入的霉菌毒素数量，防止霉菌毒素在血液及组织中大量扩散。
  脱毒剂通常可分为两类：霉菌毒素吸附剂和生物转化脱毒剂。
  这些产品吸附和降解霉菌毒素的能力必须进行测试。在进行体内试验之前，体外分析是筛选和选择脱毒剂的一个强有力的工具；体内试验的成本昂贵，应根据3R[研究所用动物的替换(Replacement)、减少(Reduction)和精选(Refinement)]原则，尽可能减少体内试验。
  科研人员已经成功开发出多种霉菌毒素检测模型，从简单的浓度测定到更为精细的模拟动物胃肠道的模型。本文的目的是调查现有的体外测试方法，以评估霉菌毒素解毒剂的功效，并确定最佳的预筛选策略。
  2  霉菌毒素脱毒剂
  目前尚无可以评估霉菌毒素脱毒剂功效的国际统一标准。在欧盟委员会发布的386/2009号委员会条例中，霉菌毒素脱毒剂在功能性饲料添加剂中被定义为“可减少霉菌毒素对饲料污染的物质，该物质可抑制或减少动物对霉菌毒素的吸收，促进霉菌毒素的排泄或改变其作用方式”。该法规所列出的饲料添加剂以化学分子式、种类和分析方法等方式进行精确定义，并在数期欧盟公报的若干法律文本中进行了详细说明。
  由于脱毒剂的理化性质和结构性，用于评估它们对霉菌毒素脱毒能力的作用机制和检测方法要视脱毒剂类型的不同而有所区别。
  2.1 霉菌毒素吸附剂
  霉菌毒素吸附剂也叫霉菌毒素结合剂，是一类以硅酸盐为主要成分的无机化合物，或者是一类碳基类有机聚合物。无机类吸附剂包括天然的黏土产品(水合铝硅酸钠钙、沸石和膨润土)以及合成多聚体，有机类吸附剂包括一些酵母细胞壁成分、活性炭、合成多聚体、腐殖质和日粮纤维。
  吸附剂能够在动物的胃肠道中吸附霉菌毒素且不会解离。通过这种方式，霉菌毒素-吸附剂复合体能够与粪便一起排出体外，因此可以减少动物吸收的霉菌毒素数量。
  不同类型分子间的交互作用可能参与相同的吸附过程(疏水性、静电吸附、分子识别)。
  2.2 生物转化脱毒剂
  霉菌毒素生物转化脱毒剂含有大量的微生物和能够降解或中和多种霉菌毒素的纯合酶，如细菌、酵母、真菌、原生动物和酶。
  在选择脱毒剂和吸附剂时，必须同时观察产品的定性和定量特性(如亲和力、容量和选择性等)。定量特性应尽可能以能够比较吸附剂并可预测不同条件下功效的方式来表述。
  3  试验性研究回顾
  霉菌毒素的体外吸附预备试验被认为是筛选有潜力的霉菌毒素脱毒剂的最佳方法。实际上，如果脱毒剂在体外试验中没有表现出吸附作用，那么它很难在动物体内发挥吸附作用。
  就霉菌毒素吸附剂而言，要测定其对霉菌毒素解毒的能力，需要进行不同类型的试验。
  3.1 “单一浓度”检测法
  “单一浓度”检测法是体外试验中应用最广泛的方法，加入特定浓度的脱毒剂后，可以测定固定浓度下水性介质中对纯的合成霉菌毒素的吸附作用。这种方法操作简单、成本低且不会浪费脱毒剂，对具有类似作用机制的吸附剂进行比较非常有效。然而，检测结果取决于吸附剂的浓度，由于不是真实的胃肠道环境，很难将结果与动物体内真实的情况关联起来。
  3.2 “等温线”检测法
  “等温线”检测法的目的是获得一条能够说明相对于介质中最早的霉菌毒素浓度的单位重量吸附剂所吸附霉菌毒素量的曲线。该检测通常能够给出恒温下某一浓度的吸附剂对不同浓度的纯霉菌毒素的吸附曲线，也可以反推。
  “等温线”检测法可以在水性介质中进行，也可以在存在或缺乏饲料基质的情况下进行。分析这些研究的结果常常可以评估与霉菌毒素污染相关的基质是否会影响吸附剂的功效。
  由于吸附研究考虑了吸收过程(平衡)的可逆性，因此能让我们更好地了解吸附剂的功效。这被认为是可以测定霉菌毒素吸附剂总吸附能力的最佳分析方法之一。
  相比“单一浓度”检测法，这些方法操作更复杂，完成对照研究需要花费更多的时间，而且成本更高。
  3.3 静态胃肠道模型和动态胃肠道模型试验
  静态胃肠道模型和动态胃肠道模型试验是使用胃肠道模型进行的体外检测法，这些模型尽量模拟猪胃肠道的生理条件，并考虑胃肠道中的消化酶及其浓度、pH、消化时间和盐浓度等因素。
  静态胃肠道模型试验在每个消化阶段使用固定浓度的酶、盐和胆汁酸，动态胃肠道模型试验可以模拟与蠕动瓣膜相连的胃肠道(胃/瘤胃、十二指肠、结肠和回肠)的不同区段，并动态加入参与消化过程的消化液，它可能包含或不包含自然污染的饲料。
  动态模型是能够与动物体内的复杂性相比的最合适方法，还可以研究霉菌毒素的生物可接受性。实际上，这一研究可以通过模拟或者建立肠道屏障模型(细胞培养)来完成。
  这种方法能够测定霉菌毒素通过动物空肠上皮细胞(如猪小肠上皮细胞)的核纤层蛋白转移，黏膜上皮单独或与吸附剂一起接触霉菌毒素。它也可以用于评估吸附剂对营养物质和(或)治疗性物质的潜在干扰，还可以评估消化道上皮细胞的细胞膜完整性。
  它为关于霉菌毒素代谢的经典体外研究提供了补充信息，这是最关键的一步。然而，这些研究需要良好的细胞生物学专业技术，并且成本昂贵。
  霉菌毒素生物转化脱毒剂对霉菌毒素的解毒性能通常利用“孵育研究”在体外进行评估。
  在适合微生物生长的条件(温度、搅动作用、有氧或者厌氧和生理合适的pH)下，微生物(细菌、真菌和酵母)与霉菌毒素在缓冲液中或者在特定肉汤培养液中混合。
  一些不同的肉汤培养液利用复杂的基质(如瘤胃液、消化糜或含饲料的基质)进行了测试。对酶而言，孵育研究通常以同样的方法在缓冲液中进行，孵育时间从几分钟到几天不等。
  要产生适合酶活性的最佳条件，温度和pH可能也不同。需要考虑的重要因素是被测脱毒剂能降解霉菌毒素而不会产生具有潜在毒性作用的代谢物。
  实际上，不一定每一种反应都会产生真正的解毒作用，因为代谢产生的产物可能具有比其母本化合物更大的毒性。例如，酵母在动物体内对玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)的生物转化就属于这种情况，它能够将ZEN还原为α-玉米赤霉烯醇，后者会产生比ZEN更强的雌激素样刺激。
  4  定量方面
  无论被测试的脱毒剂和所用的研究条件如何，都需要使用霉菌毒素定量系统。最常用的方法是液相色谱法(Liquid Chromatograpy，LC)或者气相色谱法(Gas Chromatography，GC)以及免疫化学法，如酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)。
  分析工具的类型和样品准备(提取和纯化)所用的方法高度依赖于所测定的霉菌毒素的结构。
  高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)是一种测定霉菌毒素的法定方法。此方法可与紫外分光检测、荧光检测、安培检测或荧光分光光度检测结合使用，正相HPLC和反相HPLC均可用于霉菌毒素的分离和纯化。多种霉菌毒素有自然的荧光(如棕曲霉毒素)，因此可以直接用HPLC-荧光法(HPLC-fluorescence，HPLC-FD)检测。其他霉菌毒素，如伏马菌素，可能需要上游定量步骤，如衍生作用，可以使用邻苯二甲醛或9-(芴基甲基)氯甲酸酯进行。
  气相色谱法是一种适用于检测挥发性和热稳定性化合物的技术。通过将该系统链接到质谱仪(Mass-Spectrometry，MS)、氢火焰离子化检测器或傅立叶变换红外光谱仪来完成检测。大多数霉菌毒素不具有挥发性，因此需要上游定量步骤。
  层析色谱法被认为是检测霉菌毒素最精确且最可靠的方法。然而，当体外试验要检测多个参数且分析次数很多时，昂贵的设备、必须由熟练的检测人员操作以及分析所需的时间长可能是限制此方法应用的因素。
  对检测精确、灵敏、操作简便、成本低和速度快的要求促使科研人员开发霉菌毒素定量检测的免疫学方法。这些方法基于特定的单克隆抗体或多克隆抗体具有对特定霉菌毒素(抗原)的三维结构区别分类的能力研制而成。这些可以基于免疫亲和柱分析法(Immunoaffinity Column-Based Analysis，IAC)或ELISA进行。最新方法通常用于商品试剂盒中(黄曲霉毒素试剂盒等，德国拜发公司)。
  市场上销售的数种商业试剂盒可用于体外检测。它们通常是专为检测一种霉菌毒素设计的，并且明确了应用范围、特异性和交叉反应性、准确性和精密度以及测量范围。
  在考虑选择进行体外检测的试剂盒时，所有这些参数很重要。
  除ELISA外，快速筛选测试和许多新技术(例如生物传感器)也正在不断涌现出来。
  它们通常由一个生物来源的识别元件组成，当与目标分析物接触时，识别元件会在信号转导元件中产生一个可量化的响应。大多数信号转导的机制是光学共振(比色、荧光和增强型化学发光)、电化学共振或表面离子体共振。如今，在这些有应用前景的技术中，大多数技术还处于开发阶段，并且目前体外霉菌毒素脱毒剂研究还不能用来定量霉菌毒素。
  5  结论
  目前，用脱毒剂来解决霉菌毒素污染问题有很大的发展潜力，并且许多体外检测方法可用于评估它们的功效(图1)。
  从单一浓度检测到模拟胃肠道更为复杂的模型，体外试验研究被认为是一种有用的预筛选策略，可以选择有应用前景的吸附材料或产品。