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2014—2018 年我国5株基因VII 型新城疫病毒的基因组特性


现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2020/6/6 15:25:45 关注:91 评论: 我要投稿

  摘要:为了解我国基因VII型新城疫病毒的分子生物学特性,对2014—2018年分离的5株基因VII型新城疫病毒代表株进行了基因组测序和生物信息学分析。序列分析显示:5株病毒F蛋白裂解位点为112RRQKR/F117或112RRRKR/F117,具有强毒株的典型特征;病毒基因组长度均为15192nt,其F蛋白融合肽、七肽重复区和跨膜区,以及HN蛋白跨膜区、中和抗原表位等功能区有多处氨基酸变异。病毒F基因遗传进化分析显示:2014—2015年分离的2株病毒属于基因VII.1.1亚型;2016—2018年分离的3株病毒属于基因VII.2亚型,暗示此亚型毒株可能已逐步取代基因VII.1.1亚型,成为家禽中的优势流行毒株。本研究进一步掌握了我国基因VII型新城疫病毒的遗传特性,从而为科学防控该病提供了参考。
  新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)强毒株感染引起的一种急性、高度接触性禽传染病。NDV强毒株可导致感染禽类出现典型症状和病理变化,病死率可高达100%,给养禽业造成严重经济损失,为此世界动物卫生组织(OIE)将其列为须通报动物疫病,我国将其列为一类动物疫病,并在《国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020年)》中,将其列为优先防治的重大动物疫病。NDV具有遗传多样性。根据病毒F基因序列差异,NDV可分为I类(class I)和II类(class II),其中I类只有1个基因型,II类至少有21个基因型(I—XXI)。我国流行的NDV强毒株主要为II类中的基因VI型和VII型。1984年,我国台湾地区首次发现基因VII型NDV。随后,该基因型毒株在我国家禽中广泛流行,主要为基因VII.1.1亚型。2011年,我国在广西野鸟中首次分离到基因VII.2亚型NDV。国家新城疫参考实验室监测数据显示,2012—2018年我国陆续在家禽中也分离到VII.2亚型毒株。为了解我国家禽中流行的基因VII型NDV的分子生物学特性,对2014—2018年分离的5株基因VII型NDV代表株进行了基因组测序和序列分析,以期为进一步掌握我国基因VII型NDV的遗传特性以及科学防控ND奠定基础。
  材料与方法
  病毒繁殖
  SPF鸡胚,购自山东省无特定病原实验种鸡场。将国家新城疫参考实验室保存的基因VII型NDV代表株接种9~11日龄SPF鸡胚,72h后,通过血凝(HA)试验鉴定鸡胚尿囊液,将鉴定为HA阳性的尿囊液分装,于-80℃保存。
  RNA提取
  用High Pure Viral RNA Kit(Roche)提取病毒RNA,并用于RT-PCR扩增,或置-20℃保存备用。
  病毒基因组扩增
  利用试剂盒及特异性引物,扩增病毒基因组序列。利用试剂盒扩增病毒基因组5'和3'末端。RT-PCR扩增产物,送公司测序。
  基因组序列拼接与分析
  利用Lasergene软件,参考GenBank中基因VII型NDV基因组序列,对测得序列进行拼接和编辑。利用MEGA 6软件,参考NDV F和HN蛋白功能区序列,分析5株基因VII型NDV代表株F和HN蛋白关键位点的氨基酸变异。
  基因重组分析
  利用RDP4软件,采用RDP、GeneConv、Chimaera、MaxChi、BootScan、SiScan、3Seq等算法,对5株基因VII型NDV代表株的基因组序列进行重组分析。
  遗传进化分析
  利用MEGA6软件,对毒株F基因序列进行系统进化分析;采用邻位相连法(neighbor-joining)构建系统进化树,bootstrap设置为1000次重复。
  结果
  基因VII型代表株信息
  从2014—2018年我国分离到的35株基因VII型NDV中,选取5株代表株进行基因组测序。代表株分离时间、地点、宿主等信息见表1。

  基因组序列分析
  对筛选的5株基因VII型NDV代表株进行基因组测序和序列分析。5株病毒基因组长度均为15192nt。如表2所示:分离株基因组3'和5'端长度分别为55和114nt,NP、P、M、F、HN和L基因5'端非转录区(untranslated region,UTR)均长于3'UTR;NP—P、P—M、M—F基因间隔区(intergenic sequence,IGS)长度为1nt,F—HN、HN—L的IGS分别为31和47nt。利用RDP4软件,对病毒基因组序列进行分析,未发现基因重组。
  5株病毒F蛋白长度均为553aa,与基因VII型NDV基因组长度特征一致(表2),裂解位点处有4个以上碱性氨基酸(表1),符合强毒株特征。与大部分NDV相似,5株病毒F蛋白有6个潜在的N-糖基化位点(N-X-S/T)。与NDV F蛋白功能区参考序列相比,JS1816/2014和SD142/2015的F蛋白融合肽(fusion   peptide)序列相对保守,但在七肽重复区(heptad repeat region,HR)和跨膜区(transmembrane domain)有多处氨基酸变异;其余3株病毒在融合肽、七肽重复区和跨膜区均出现氨基酸变异,其中YN1027/2016和YN1135/2017各有6个氨基酸变异,YN2073/2018有5个氨基酸变异(表3)。

 

  5株病毒HN蛋白长度均为571aa,与基因VII型NDV基因组长度一致(表2),有5个N-糖基化位点,分别为119(NNS/NSS)、341(NNT/NDT)、433(NKT)、481(NHT)、508(NIS),跨膜区有多处氨基酸变异(表3)。与NDV疫苗株(La Sota、V4、Clone 30、B1)相比,YN1027/2016和YN1135/2017在HN蛋白中和抗原表位有2个氨基酸变异(N263R,I514V),YN2073/2018有3个氨基酸变异,增加了Q348H,JS1816/2014和SD142/2015,各有4个氨基酸变异,其E347位也发生变异(表4)。

 

  遗传进化分析
  对基因VII型代表株F基因进行遗传进化分析,发现我国基因VII型分离株具有遗传多样性:2014—2015年分离的2株病毒属于基因VII.1.1亚型,2016—2018年分离的3株病毒属于基因VII.2亚型(图1)。

 

  讨论
  NDV具有遗传多样性,根据病毒F基因差异,NDV可分为两大类:I类大多为弱毒株;II类毒力差异较大,既有引发大流行的强毒株,也有常用弱毒疫苗株。根据最新的基因分型方法,I类NDV只有1个基因型、3个基因亚型;II类NDV至少包括21个基因型。目前,我国流行的NDV强毒株主要为基因VI型、VII型,且具有较强的宿主特异性。基因VI型NDV主要分布于鸽群,基因VII型主要分离自鸡和水禽。20世纪90年代后,基因VII.1.1亚型NDV开始在我国家禽中广泛流行。2011年,我国在广西野鸟中首次分离到基因VII.2亚型NDV。这种新型病毒2005年首次出现于马来西亚,随后在印度尼西亚、越南、柬埔寨、南非共和国和莫桑比克等东南亚和非洲国家也分离到该亚型毒株。2012年我国在贵州省鸡群中分离到基因VII.2亚型NDV,2013—2018年陆续在鸡和水禽(鸭、鹅)中分离到同类病毒。国家新城疫参考实验室监测数据显示,2016年至今,我国基因VII型NDV分离株主要为基因VII.2亚型,暗示此亚型毒株可能已逐步取代基因VII.1.1亚型,成为家禽中的优势流行毒株。
  NDV为单股负链RNA病毒,基因组由6个基因片段(NP、P、M、F、HN、L)组成,至少包括3种长度。I类NDV基因组长度为15198nt,II类为15186nt(基因I—IV型)或15192nt(基因V—XXI型)。本研究中的5株基因VII型NDV代表株基因组长度均为15192nt。NDV F蛋白裂解位点氨基酸与病毒毒力相关。5株病毒F蛋白裂解位点为112RRQKR/F117或112RRRKR/F117,均符合强毒特征,且其HN蛋白长度均为571aa,与大部分NDV强毒株一致。NDV F蛋白七肽重复区和跨膜区氨基酸变异可影响病毒F蛋白融合活性,HN蛋白中和抗原表位氨基酸变异可协助病毒逃避宿主免疫应答。本研究中,5株病毒在F蛋白七肽重复区和跨膜区,以及HN蛋白跨膜区和中和抗原表位均有氨基酸变异,且JS1816/2014出现与病毒免疫原性相关的E347K变异。
  2014—2018年,我国在鸡群和鸭群中分离到多株基因VII型NDV,且各分支中,不同宿主来源病毒的F基因高度同源,说明基因VII型NDV可在家养陆禽和水禽间传播。目前,分离到的基因VII型NDV均来源于活禽市场。由于活禽市场家禽种类多、来源复杂,市场卫生条件较差,极易导致病毒传播和混合感染,因此应加强活禽市场的生物安全管理,严格执行消毒、休市等措施。同时,也应加强活禽市场的NDV监测,并进一步研究NDV强毒株的生物学特性,为科学防控ND提供依据。

 

文章作者:王静静等 中国动物检疫     文章编辑:一米优讯     
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