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摘要：为了解我国基因VII型新城疫病毒的分子生物学特性，对2014—2018年分离的5株基因VII型新城疫病毒代表株进行了基因组测序和生物信息学分析。序列分析显示：5株病毒F蛋白裂解位点为112RRQKR/F117或112RRRKR/F117，具有强毒株的典型特征；病毒基因组长度均为15192nt，其F蛋白融合肽、七肽重复区和跨膜区，以及HN蛋白跨膜区、中和抗原表位等功能区有多处氨基酸变异。病毒F基因遗传进化分析显示：2014—2015年分离的2株病毒属于基因VII.1.1亚型；2016—2018年分离的3株病毒属于基因VII.2亚型，暗示此亚型毒株可能已逐步取代基因VII.1.1亚型，成为家禽中的优势流行毒株。本研究进一步掌握了我国基因VII型新城疫病毒的遗传特性，从而为科学防控该病提供了参考。
新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）强毒株感染引起的一种急性、高度接触性禽传染病。NDV强毒株可导致感染禽类出现典型症状和病理变化，病死率可高达100%，给养禽业造成严重经济损失，为此世界动物卫生组织（OIE）将其列为须通报动物疫病，我国将其列为一类动物疫病，并在《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020年）》中，将其列为优先防治的重大动物疫病。NDV具有遗传多样性。根据病毒F基因序列差异，NDV可分为I类（class I）和II类（class II），其中I类只有1个基因型，II类至少有21个基因型（I—XXI）。我国流行的NDV强毒株主要为II类中的基因VI型和VII型。1984年，我国台湾地区首次发现基因VII型NDV。随后，该基因型毒株在我国家禽中广泛流行，主要为基因VII.1.1亚型。2011年，我国在广西野鸟中首次分离到基因VII.2亚型NDV。国家新城疫参考实验室监测数据显示，2012—2018年我国陆续在家禽中也分离到VII.2亚型毒株。为了解我国家禽中流行的基因VII型NDV的分子生物学特性，对2014—2018年分离的5株基因VII型NDV代表株进行了基因组测序和序列分析，以期为进一步掌握我国基因VII型NDV的遗传特性以及科学防控ND奠定基础。
材料与方法
病毒繁殖
SPF鸡胚，购自山东省无特定病原实验种鸡场。将国家新城疫参考实验室保存的基因VII型NDV代表株接种9~11日龄SPF鸡胚，72h后，通过血凝（HA）试验鉴定鸡胚尿囊液，将鉴定为HA阳性的尿囊液分装，于-80℃保存。
RNA提取
用High Pure Viral RNA Kit（Roche）提取病毒RNA，并用于RT-PCR扩增，或置-20℃保存备用。
病毒基因组扩增
利用试剂盒及特异性引物，扩增病毒基因组序列。利用试剂盒扩增病毒基因组5'和3'末端。RT-PCR扩增产物，送公司测序。
基因组序列拼接与分析
利用Lasergene软件，参考GenBank中基因VII型NDV基因组序列，对测得序列进行拼接和编辑。利用MEGA 6软件，参考NDV F和HN蛋白功能区序列，分析5株基因VII型NDV代表株F和HN蛋白关键位点的氨基酸变异。
基因重组分析
利用RDP4软件，采用RDP、GeneConv、Chimaera、MaxChi、BootScan、SiScan、3Seq等算法，对5株基因VII型NDV代表株的基因组序列进行重组分析。
遗传进化分析
利用MEGA6软件，对毒株F基因序列进行系统进化分析；采用邻位相连法（neighbor-joining）构建系统进化树，bootstrap设置为1000次重复。
结果
基因VII型代表株信息
从2014—2018年我国分离到的35株基因VII型NDV中，选取5株代表株进行基因组测序。代表株分离时间、地点、宿主等信息见表1。
基因组序列分析
对筛选的5株基因VII型NDV代表株进行基因组测序和序列分析。5株病毒基因组长度均为15192nt。如表2所示：分离株基因组3'和5'端长度分别为55和114nt，NP、P、M、F、HN和L基因5'端非转录区（untranslated region，UTR）均长于3'UTR；NP—P、P—M、M—F基因间隔区（intergenic sequence，IGS）长度为1nt，F—HN、HN—L的IGS分别为31和47nt。利用RDP4软件，对病毒基因组序列进行分析，未发现基因重组。
5株病毒F蛋白长度均为553aa，与基因VII型NDV基因组长度特征一致（表2），裂解位点处有4个以上碱性氨基酸（表1），符合强毒株特征。与大部分NDV相似，5株病毒F蛋白有6个潜在的N-糖基化位点（N-X-S/T）。与NDV F蛋白功能区参考序列相比，JS1816/2014和SD142/2015的F蛋白融合肽（fusion peptide）序列相对保守，但在七肽重复区（heptad repeat region，HR）和跨膜区（transmembrane domain）有多处氨基酸变异；其余3株病毒在融合肽、七肽重复区和跨膜区均出现氨基酸变异，其中YN1027/2016和YN1135/2017各有6个氨基酸变异，YN2073/2018有5个氨基酸变异（表3）。
5株病毒HN蛋白长度均为571aa，与基因VII型NDV基因组长度一致（表2），有5个N-糖基化位点，分别为119（NNS/NSS）、341（NNT/NDT）、433（NKT）、481（NHT）、508（NIS），跨膜区有多处氨基酸变异（表3）。与NDV疫苗株（La Sota、V4、Clone 30、B1）相比，YN1027/2016和YN1135/2017在HN蛋白中和抗原表位有2个氨基酸变异（N263R，I514V），YN2073/2018有3个氨基酸变异，增加了Q348H，JS1816/2014和SD142/2015，各有4个氨基酸变异，其E347位也发生变异（表4）。
遗传进化分析
对基因VII型代表株F基因进行遗传进化分析，发现我国基因VII型分离株具有遗传多样性：2014—2015年分离的2株病毒属于基因VII.1.1亚型，2016—2018年分离的3株病毒属于基因VII.2亚型（图1）。
讨论
NDV具有遗传多样性，根据病毒F基因差异，NDV可分为两大类：I类大多为弱毒株；II类毒力差异较大，既有引发大流行的强毒株，也有常用弱毒疫苗株。根据最新的基因分型方法，I类NDV只有1个基因型、3个基因亚型；II类NDV至少包括21个基因型。目前，我国流行的NDV强毒株主要为基因VI型、VII型，且具有较强的宿主特异性。基因VI型NDV主要分布于鸽群，基因VII型主要分离自鸡和水禽。20世纪90年代后，基因VII.1.1亚型NDV开始在我国家禽中广泛流行。2011年，我国在广西野鸟中首次分离到基因VII.2亚型NDV。这种新型病毒2005年首次出现于马来西亚，随后在印度尼西亚、越南、柬埔寨、南非共和国和莫桑比克等东南亚和非洲国家也分离到该亚型毒株。2012年我国在贵州省鸡群中分离到基因VII.2亚型NDV，2013—2018年陆续在鸡和水禽（鸭、鹅）中分离到同类病毒。国家新城疫参考实验室监测数据显示，2016年至今，我国基因VII型NDV分离株主要为基因VII.2亚型，暗示此亚型毒株可能已逐步取代基因VII.1.1亚型，成为家禽中的优势流行毒株。
NDV为单股负链RNA病毒，基因组由6个基因片段（NP、P、M、F、HN、L）组成，至少包括3种长度。I类NDV基因组长度为15198nt，II类为15186nt（基因I—IV型）或15192nt（基因V—XXI型）。本研究中的5株基因VII型NDV代表株基因组长度均为15192nt。NDV F蛋白裂解位点氨基酸与病毒毒力相关。5株病毒F蛋白裂解位点为112RRQKR/F117或112RRRKR/F117，均符合强毒特征，且其HN蛋白长度均为571aa，与大部分NDV强毒株一致。NDV F蛋白七肽重复区和跨膜区氨基酸变异可影响病毒F蛋白融合活性，HN蛋白中和抗原表位氨基酸变异可协助病毒逃避宿主免疫应答。本研究中，5株病毒在F蛋白七肽重复区和跨膜区，以及HN蛋白跨膜区和中和抗原表位均有氨基酸变异，且JS1816/2014出现与病毒免疫原性相关的E347K变异。
2014—2018年，我国在鸡群和鸭群中分离到多株基因VII型NDV，且各分支中，不同宿主来源病毒的F基因高度同源，说明基因VII型NDV可在家养陆禽和水禽间传播。目前，分离到的基因VII型NDV均来源于活禽市场。由于活禽市场家禽种类多、来源复杂，市场卫生条件较差，极易导致病毒传播和混合感染，因此应加强活禽市场的生物安全管理，严格执行消毒、休市等措施。同时，也应加强活禽市场的NDV监测，并进一步研究NDV强毒株的生物学特性，为科学防控ND提供依据。
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