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弓形虫病诊断方法研究进展


现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2020/6/6 15:26:24 关注:286 评论: 我要投稿

  摘要:弓形虫病(toxoplasmosis)是一种由弓形虫引起的严重危害人类及动物健康的人兽共患原虫病。目前没有理想的治疗药物,早期确诊是有效的防控手段之一。本文从病原学、免疫学、分子生物学角度,总结了各诊断方法的优缺点。病原学检测虽然操作简便,但不适于大规模检测,而且费时费力,灵敏度低;免疫学检测方法操作简便、特异性和敏感性强,其中ELISA方法是最常用的一种检测方法;分子生物学检测虽然准确性、灵敏度、特异性较高,但大多操作比较繁琐,需要特殊的仪器设备。提出未来研究方向是研制适于大量样品检测以及流行病学调查的商品化ELISA方法试剂盒,以及可直接对多种组织中弓形虫病原进行检测的商品化分子生物学试剂盒。
  弓形虫病(toxoplasmosis)是由刚地弓形虫(Toxoplsma gondii)引起的呈世界性分布的严重危害人类健康和畜牧业发展的人兽共患寄生虫病。弓形虫主要寄生在细胞内部,人类通过进食未煮熟的含有弓形虫卵囊的食物或者被污染的水源而感染。健康人群感染后无明显的临床症状,但是免疫功能低下的人群感染后则会引起严重的后果:孕妇感染后会导致流产,产弱胎、畸胎、死胎等;器官移植的病人,由于免疫抑制剂的使用导致机体免疫功能下降,感染后病原会在多个器官迅速增殖,导致机体功能衰退。弓形虫感染是艾滋病患者中常见的机会性感染,感染引起的免疫抑制使潜伏感染再激活导致严重的甚至可能致命的脑炎。弓形虫病不仅对人类的健康存在着威胁,也给畜牧产业带来了巨大的经济损失。2004年,弓形虫病曾在我国的猪场大肆流行,死亡率高达60%,严重影响了当时的养猪产业。不仅如此,此病会使怀孕动物出现流产、产死胎,还会使患病动物死亡,对动物健康造成了极大威胁。该病目前无有效治疗药物,早期确诊是有效的控制手段之一。本文从病原学、免疫学和分子生物学方面,综述了各诊断技术的研究进展以期为疫病诊断方法的选择提供参考。
  病原学诊断
  目前常用的弓形虫病检测方法为显微镜镜检和动物接种。显微镜镜检是选取样本的病变部位或者将粪便和水中的卵囊过滤之后涂片、固定并使用吉姆萨染色和HE染色方法对包囊染色,最后观察结果。Khademvatan等通过显微镜对伊朗的多只啮齿动物涂片进行了弓形虫病检测,结果有1例感染了弓形虫病;利用PCR方法检测出弓形虫阳性样品41份;血清学方法检测弓形虫抗体阳性率与PCR方法检测结果相近。这说明镜检方法虽然可直接观察到病原,但检出率较低,不适合作为单一方法用于检测弓形虫病原。除此之外,动物接种法也常应用于弓形虫诊断,该方法将病料接种至易感动物体内或通过细胞培养等方式对弓形虫进行检测。孙新利用小鼠腹腔接种和THP21细胞培养的方法,对30头孕鼠的羊水进行弓形虫分离鉴定,共分离得到6株弓形虫,细胞培养组平均阳性时间8d,而接种组平均阳性时间为9周,检测所需时间都较长。病原学诊断方法虽然操作简便,但步骤繁琐,耗时长,灵敏度低等,无法满足高效、快速的检测需求,因此在实验室诊断方面应用较少。
  免疫学诊断
  免疫学诊断方法常被应用于弓形虫病检测,包括染色试验(sabin-feldman dye test,DT)、凝集试验和酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)等。
  染色试验(DT)
  染色试验于1948年首次创立,只适用于弓形虫感染,特异性较强。染色试验是通过弓形虫分别与阴性和阳性血清作用后,根据碱性美蓝液染色结果判断被检体内是否含有弓形虫抗体。赵恒梅等通过该方法对11份阳性兔血清和34份弓形虫病人的血清进行检测,发现阳性率分别为100%和94.1%,并与血吸虫病、肺吸虫病、疟疾等均无交叉反应。染色试验由于其特异性强、敏感性高等优势曾被称为最有价值的检测方法,在早期的诊断中被广泛使用。但此方法使用的抗原必须为活体,且不利于操作,存在着巨大的危险性,因此被限制使用。
  凝集试验
  凝集试验主要包括直接凝集试验(direct agglutination test,DAT)、间接血凝试验(indirect hem agglutination test,IHA)、乳胶凝集试验(latex agglutination test,LAT)、改良凝集试验(mend agglutination test,MAT)。
  直接凝集试验(DAT)。直接凝集试验是用甲醛固定弓形虫悬液来作为抗原,与被检血清直接进行反应。在载玻片加入稀释度不同的试验血清,混匀,几分钟后在显微镜下观察,如果发生凝集现象,则证明为阳性,反之为阴性。1991年,张述义等通过微孔板法建立了检测弓形虫IgG抗体的直接凝集试验,通过这种方法能检测出早期感染的IgG抗体。
  间接血凝试验(IHA)。间接血凝试验是利用弓形虫可溶性抗原致敏于红细胞表面,当其与相应的抗体产生反应时,可以用肉眼观察到凝集现象。间接血凝试验比直接凝集试验灵敏性高,特异性强,因而常用该方法进行流行病调查。但间接血凝试验也存在不足,包括重复性比较差,致敏红细胞不稳定和易发生非特异凝集等缺点。
  乳胶凝集试验(LAT)。乳胶凝集试验是将乳胶颗粒包被可溶性的抗原,加入待检血清后充分震荡混匀,室温过夜后进行观察;如果发生凝集现象,则证明感染弓形虫。该方法操作简单,结果易于观察,但费时且特异性不强,在弓形虫检测中不常使用。
  改良凝集试验(MAT)。改良凝集试验是由Dubey和Desmonts于1987年在直接凝集试验的基础上建立了一种敏感的弓形虫检测方法。Feg等用此试验方法对散养的鸡群进行了检测,结果发现散养鸡群感染率为16.6%。Heddergott等也用此试验方法对浣熊进行了检测,发现有37.4%的浣熊感染弓形虫。该方法特异敏感性强,但存在费时、检测费用高等缺点。
  酶联免疫吸附试验(ELISA)
  ELISA试验是利用酶的高效催化作用以及底物放大的反应原理,提高特异性抗原和抗体免疫反应检测的敏感性。该方法可以检测出弓形虫感染各个时期的IgM、IgG、IgA和IgE抗体,敏感性较好。管刚等2008年用弓形虫的重组蛋白P30作为抗原建立了ELISA方法,并用此方法对收集的139份猪血清抗体进行检测,共检测出阳性血清8份,阳性率为5.76%。罗才庆等比较ELISA和HAT试验方法,结果表明ELISA更适合用于检测猪弓形虫抗体。近年来随着该技术的不断发展,科研人员又研究出了许多改进方法,如葡萄球菌A蛋白ELISA、斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)、PCR-ELISA、双夹心酶联免疫吸附试验(DS-ELISA)等。据调查,ELISA检测方法是国内外学者以及实验室检测弓形虫抗体最常用的方法。目前,已研制出反应灵敏、特异性高、重复性好的动物弓形虫ELISA试剂盒。如:检测弓形虫 IgM抗体的间接 ELISA法试剂盒(该种方法对于急性病例检出率较高,但类风湿因子阳性者易出现假阳性反应),可去除类风湿干扰的双夹心法ELISA检测试剂盒。
  间接荧光抗体试验(FAT)
  间接荧光抗体试验是用固定的弓形虫速殖子制作抗原片,通过荧光素标记的二抗检测特异性抗体。此方法特异性和敏感性较高,重复性也很高,在国外被广泛应用。但我国利用FAT方法检测弓形虫的报道非常少。此试验方法需要用专业荧光显微镜来进行观察,所以在国内没有大面积推广使用。
  分子生物学诊断
  核酸探针技术
  核酸探针技术又被称为核酸杂交技术(nucleic acid hybridization),是1968年华盛顿卡内基学院的Roy Britten及同事们所发明。核酸探针技术作为重要的分子生物学技术,通过将特定的病原基因序列分离纯化后标记作为探针,与待检的DNA和RNA单链形成杂交双链,最后将标记物洗去,用自显影技术对其检测,从而检测出与特定序列结合的核酸样品,最终达到检测病原的目的。Blanco等建立弓形虫RH株基因文库,从中筛选出pTg4重复片段。将此片段用放射性同位素32P标记作为探针,可检测到80pg纯化的弓形虫基因组DNA。由于放射性同位素标记的核酸探针容易污染环境,且对人体有一定损害,所以在使用上受到一定的限制。
  聚合酶链式反应(PCR)
  PCR技术可以在比较短的时间内对弓形虫基因组特定的片段进行扩增,通过扩增产生数百万个拷贝的靶DNA分子。Nabi等对PCR方法与显微镜法进行了比较,对于检测猫粪便弓形虫卵囊,PCR检测方法更为可靠。Lukasove等分别收集了南非野鸟、家养鸟的110份、15份脑组织样本,并对其进行了PCR检测,发现2.7%的野鸟感染了弓形虫。研究表明,PCR检测方法速度快、灵敏度高、结果可靠。正因如此,PCR技术才得以广泛使用,在弓形虫病的临床诊断中占有重要作用。
  环介导等温扩增技术(LAMP)
  LAMP是Notomi等人在2000年开发的一种等温核酸扩增方法。LAMP是在Bst DNA聚合酶的参与下,用4对引物识别弓形虫靶基因的6个区域,在等温条件下使靶基因高效扩增。扩增产物既可以通过荧光定量、电泳检测,也可以通过离心后肉眼观察沉淀。LAMP进行检测时只需要水浴或者用普通的加热装置,就可以直接观察出扩增的产物。因此LAMP是在没有精密仪器下,仍能快速、简便得出结果的一种检测方法。此方法的灵敏度和扩增效率要比常规的PCR方法高很多。Zhang等根据弓形虫529bp重复序列建立LAMP方法,与常规PCR方法同时对疑似感染弓形虫的猪淋巴结样本进行检测,结果LAMP阳性率为85.7%,而常规PCR阳性率为76.9%;Krasteva等利用弓形虫单一拷贝的SAG1基因设计引物建立了LAMP诊断方法,对人工感染弓形虫小鼠的不同组织样本进行弓形虫检测,并与常规PCR方法进行比较,发现其灵敏度明显高于常规PCR。
  展望
  弓形虫病是一种人兽共患病,不仅对畜牧业造成严重的经济损失,而且对人类健康也构成了严重威胁。由于该病临床症状缺乏较强的特异性,导致检测技术发展较慢。随着国内外对弓形虫病研究的重视,未来适合于大量样品检测以及流行病学调查的商品化ELISA方法试剂盒,可直接对多种组织中弓形虫病原进行检测的商品化分子生物学试剂盒将得到进一步推广和应用,从而快速、准确诊断出弓形虫病原,以达到预防控制弓形虫病,减少经济损失和保障人类健康的目的。
文章作者:姚贵哲等 中国动物检疫     文章编辑:一米优讯     
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