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牛结核病污染场4种检测方法评估


现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2020/6/23 10:38:23 关注:153 评论: 我要投稿

  摘要:为寻找最适合牛结核病污染场的检测方法,加快牛结核病净化,采用牛结核菌素(PPD)皮内变态反应试验(TST)、比较皮内变态反应试验(SICTT)、牛结核病ELISA-γ-干扰素试验(IFN-γ-ELISA)、牛结核病抗体ELISA试验4种方法,对某结核病污染牛场300头奶牛进行检测,并以TST为参考标准,对不同检测方法的检测结果进行对比分析。结果显示,这4种方法中,IFN-γ-ELISA的阳性检出率最高,与TST相比,差异显著(P<0.05),而其他方法的阳性检出率均低于TST。结果表明,IFN-γ-ELISA方法的检测敏感性较高,在牛结核病污染场净化初期使用,可以尽量避免阳性牛漏检,从而加快牛结核病净化进程。
  牛结核病(bovine tuberculosis,bTB)是由分枝杆菌属牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis,M. bovis)引起的一种人兽共患慢性消耗性传染性疾病,给我国养牛业带来严重危害。世界动物卫生组织(OIE)将其列为须通报动物疫病,我国将其列为二类动物疫病。牛分枝杆菌感染宿主广泛,除可感染人外,还可感染50多种哺乳动物。牛结核病目前尚无有效疫苗预防,药物治疗成本太高,所以“检测+扑杀”是控制该疫病的主要手段。
  我国目前的牛结核病检测方法主要包括,结核菌素(PPD)皮内变态反应试验(TST)、比较皮内变态反应试验(SICTT)、γ-干扰素ELISA试验(IFN-γ-ELISA)、抗体ELISA试验和胶体金检测等。TST是我国牛结核病检测的国家标准,也是国际贸易指定方法。此方法灵敏度高,但特异性差,无法排除其他结核杆菌干扰。SICTT与TST相比,可排除其他杆菌干扰,减少假阳性。TST和SICTT检测成本低,但操作麻烦、耗时长,结果判定主观性强。IFN-γ-ELISA试验操作简单,但成本较高。抗体ELISA是现代抗体检测的主要方法,但牛分枝杆菌抗原表位复杂,不同阶段可产生不同抗体,因而导致检测阳性率偏低。
  结核病污染场内,牛分枝杆菌普遍存在,需要敏感性更高的检测方法,来尽量避免漏检,从而加快净化进程。本试验采用TST、SICTT、IFN-γ-ELISA和抗体ELISA 4种检测方法,同时对牛结核病污染场的牛群进行检测,比较分析不同试验的检测结果,以期为我国牛结核病污染场的净化提供有效的检测方法。
  材料与方法
  材料
  试验动物。某规模养殖场的300头泌乳牛。
  方法
  检测方法
  TST试验。按照国家标准《动物结核病诊断技术》(GB/T 18645—2002)的要求操作和结果判定:采用牛型PPD,剂量为2000IU,分别于注射前和注射后72h测量皮肤厚度,并计算皮厚差。皮厚差≥4.0mm,为阳性;2.0mm≤皮厚差<4.0mm,为疑似;皮厚差<2.0mm,为阴性。疑似牛于第1次检疫 60d后进行复检,仍为疑似时,60d后再复检,如仍为疑似,则判为阳性。
  SICTT试验。采用牛PPD和禽PPD,在牛颈部左侧分点皮内注射,注射点间隔12~15cm,72h后,观察注射部位的炎性反应,并量取皮皱厚,根据皮皱厚增加值判定。牛型PPD皮厚差减去禽型PPD皮厚差>4mm,判为阳性;1mm<牛型PPD皮厚差减去禽型PPD皮厚差≤4mm,判为可疑;牛型PPD皮厚差≤禽型PPD皮厚差,判为阴性。
  IFN-γ-ELISA试验。采集5mL血液肝素抗凝血液,各取1.5mL加入3个孔中,然后分别取100μL的牛型PPD、禽型PPD和阴性对照磷酸盐缓冲液(PBS),加入抗凝全血中,混匀后放于含5% CO2的培养箱中37℃培养18h。用移液器小心吸取培养上清,转入1.5mL离心管中,即获得刺激产生的γ-干扰素上清。取出单抗包被板,每孔加入50μL样品稀释液,然后加入50μL待测样品或对照,混匀后室温作用1h;洗涤,每孔加入100μL酶标抗体,室温作用1h;洗涤后每孔加入100μL底物,室温避光作用30min后,加入终止液,测定OD450nm值。当牛型PPD刺激上清的OD值-PBS刺激上清的OD值≥0.1,且牛型PPD刺激上清OD值-禽型PPD刺激上清OD值≥0.1,为阳性,反之为阴性。
  抗体ELISA试验。按照牛分枝杆菌ELISA抗体检测试剂盒操作步骤进行,计算S/P值。S/P=(样品OD450nm平均值-阴性对照OD450nm平均值)/(阳性对照OD450nm平均值-阴性对照OD450nm平均值)。S/P≥0.3为阳性,S/P<0.3为阴性。
  评估方法
  以TST试验为参考标准,分别与SICTT、IFN-γ-ELISA、抗体ELISA检测结果比较,计算符合率,运用SPSS软件进行对比,分析敏感性差异。
  结果与分析
  TST与IFN-γ-ELISA
  对比结果(表1)显示:TST检出阳性114份,IFN-γ-ELISA检出阳性154份,符合率为72.7%,经SPSS分析,P<0.05,说明IFN-γ-ELISA阳性检出率显著高于TST,表明其敏感性明显高于TST。

  TST与SICTT
  对比结果(表2)显示:TST检出阳性114份,SICTT检出阳性103份,符合率为96.3%,经SPSS分析,P>0.05,说明SICTT阳性检出率略低于TST,差异不显著,表明两种方法的敏感性相似。

 

  TST与抗体ELISA
  对比结果(表3)显示:TST检出阳性114份,抗体ELISA检出阳性21份,符合率为69.0%,经SPSS分析,P<0.05,说明抗体ELISA阳性检出率显著低于TST,表明其敏感性明显低于TST。

 

  讨论
  近年来,我国牛结核病流行率普遍升高,结核病污染场数量逐渐增加。本试验利用4种检测方法,对结核病污染场的奶牛进行检测。以TST 为参考标准,分别与其他3种方法进行比较,结果发现IFN-γ-ELISA敏感性最高,明显大于TST,而其他2种方法的敏感性都低于TST。在牛结核病污染场的净化过程中,要将所有感染牛尽可能全部筛检出来,这就需要敏感性高的检测方法,因此IFN-γ-ELISA是首选的检测方法。
  TST试验是国家标准,也是国际贸易指定方法,但其结果判定存在人为误差,尤其是大量检测时,会出现阳性漏检。在牛结核病污染场的净化初期,需要进行大量检测,如果采用TST检测,就会漏检感染牛,使其继续污染牛群。SICTT虽然可排除禽结核杆菌的干扰,检测结果准确,但其阳性检出率更低,同样不适合牛结核病污染场初期的净化。抗体ELISA检测是现代血清检测的主要方法,操作简单、耗时少,但因不同感染阶段的牛分支杆菌抗体比较复杂,无法准确捕获,导致阳性检出率也明显比TST偏低,因此也不适合用于牛结核病污染场初期的净化检测。
  TST和SICTT这两种方法适合在基层推广,成本低,但主观性强,检测过程对牛的应激影响较大。抗体ELISA检测时间短,出结果快,但成本较高,阳性检出率偏低。IFN-γ-ELISA操作复杂、成本高,检测要求较高,不适合在基层推广,但检测敏感性高。因此,在实际的牛结核病检测中,应根据不同的需要和条件,选择合适的检测方法,也可以不同方法联合使用。在条件不允许情况下,可以用TST对牛结核病污染场进行检测。因IFN-γ-ELISA是4个方法中最敏感的方法,所以在条件允许的情况下,在牛结核病污染场最适合选用,这样可以尽量避免漏检感染牛。在牛结核病污染场,患结核病的牛数量较多,如果检测方法不敏感,就会导致大量阳性牛漏检,使牛群净化困难。如果每年春秋两季,对牛场进行IFN-γ-ELISA检测,及时隔离淘汰阳性牛,连续检测几年,牛场就会达到净化目标。
  结论
  评估认为,在TST、SICTT、IFN-γ-ELISA和抗体ELISA 4种检测方法中,IFN-γ-ELISA方法敏感性最高,阳性检出率最高,可以尽可能地将感染牛全部检出,减少漏检,因此最适合用于牛结核病污染场初期的净化。
文章作者:张建东等 中国动物检疫     文章编辑:一米优讯     
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