牛结核病污染场4种检测方法评估

现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2020/6/23 10:38:23 关注：643 评论： 我要投稿

  摘要：为寻找最适合牛结核病污染场的检测方法，加快牛结核病净化，采用牛结核菌素（PPD）皮内变态反应试验（TST）、比较皮内变态反应试验（SICTT）、牛结核病ELISA-γ-干扰素试验（IFN-γ-ELISA）、牛结核病抗体ELISA试验4种方法，对某结核病污染牛场300头奶牛进行检测，并以TST为参考标准，对不同检测方法的检测结果进行对比分析。结果显示，这4种方法中，IFN-γ-ELISA的阳性检出率最高，与TST相比，差异显著（P<0.05），而其他方法的阳性检出率均低于TST。结果表明，IFN-γ-ELISA方法的检测敏感性较高，在牛结核病污染场净化初期使用，可以尽量避免阳性牛漏检，从而加快牛结核病净化进程。
  牛结核病（bovine tuberculosis，bTB）是由分枝杆菌属牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis，M. bovis）引起的一种人兽共患慢性消耗性传染性疾病，给我国养牛业带来严重危害。世界动物卫生组织（OIE）将其列为须通报动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。牛分枝杆菌感染宿主广泛，除可感染人外，还可感染50多种哺乳动物。牛结核病目前尚无有效疫苗预防，药物治疗成本太高，所以“检测+扑杀”是控制该疫病的主要手段。
  我国目前的牛结核病检测方法主要包括，结核菌素（PPD）皮内变态反应试验（TST）、比较皮内变态反应试验（SICTT）、γ-干扰素ELISA试验（IFN-γ-ELISA）、抗体ELISA试验和胶体金检测等。TST是我国牛结核病检测的国家标准，也是国际贸易指定方法。此方法灵敏度高，但特异性差，无法排除其他结核杆菌干扰。SICTT与TST相比，可排除其他杆菌干扰，减少假阳性。TST和SICTT检测成本低，但操作麻烦、耗时长，结果判定主观性强。IFN-γ-ELISA试验操作简单，但成本较高。抗体ELISA是现代抗体检测的主要方法，但牛分枝杆菌抗原表位复杂，不同阶段可产生不同抗体，因而导致检测阳性率偏低。
  结核病污染场内，牛分枝杆菌普遍存在，需要敏感性更高的检测方法，来尽量避免漏检，从而加快净化进程。本试验采用TST、SICTT、IFN-γ-ELISA和抗体ELISA 4种检测方法，同时对牛结核病污染场的牛群进行检测，比较分析不同试验的检测结果，以期为我国牛结核病污染场的净化提供有效的检测方法。
  材料与方法
  材料
  试验动物。某规模养殖场的300头泌乳牛。
  方法
  检测方法
  TST试验。按照国家标准《动物结核病诊断技术》（GB/T 18645—2002）的要求操作和结果判定：采用牛型PPD，剂量为2000IU，分别于注射前和注射后72h测量皮肤厚度，并计算皮厚差。皮厚差≥4.0mm，为阳性；2.0mm≤皮厚差＜4.0mm，为疑似；皮厚差＜2.0mm，为阴性。疑似牛于第1次检疫 60d后进行复检，仍为疑似时，60d后再复检，如仍为疑似，则判为阳性。
  SICTT试验。采用牛PPD和禽PPD，在牛颈部左侧分点皮内注射，注射点间隔12~15cm，72h后，观察注射部位的炎性反应，并量取皮皱厚，根据皮皱厚增加值判定。牛型PPD皮厚差减去禽型PPD皮厚差＞4mm，判为阳性；1mm＜牛型PPD皮厚差减去禽型PPD皮厚差≤4mm，判为可疑；牛型PPD皮厚差≤禽型PPD皮厚差，判为阴性。
  IFN-γ-ELISA试验。采集5mL血液肝素抗凝血液，各取1.5mL加入3个孔中，然后分别取100μL的牛型PPD、禽型PPD和阴性对照磷酸盐缓冲液（PBS），加入抗凝全血中，混匀后放于含5% CO2的培养箱中37℃培养18h。用移液器小心吸取培养上清，转入1.5mL离心管中，即获得刺激产生的γ-干扰素上清。取出单抗包被板，每孔加入50μL样品稀释液，然后加入50μL待测样品或对照，混匀后室温作用1h；洗涤，每孔加入100μL酶标抗体，室温作用1h；洗涤后每孔加入100μL底物，室温避光作用30min后，加入终止液，测定OD450nm值。当牛型PPD刺激上清的OD值-PBS刺激上清的OD值≥0.1，且牛型PPD刺激上清OD值-禽型PPD刺激上清OD值≥0.1，为阳性，反之为阴性。
  抗体ELISA试验。按照牛分枝杆菌ELISA抗体检测试剂盒操作步骤进行，计算S/P值。S/P=（样品OD450nm平均值-阴性对照OD450nm平均值）/（阳性对照OD450nm平均值-阴性对照OD450nm平均值）。S/P≥0.3为阳性，S/P＜0.3为阴性。
  评估方法
  以TST试验为参考标准，分别与SICTT、IFN-γ-ELISA、抗体ELISA检测结果比较，计算符合率，运用SPSS软件进行对比，分析敏感性差异。
  结果与分析
  TST与IFN-γ-ELISA
  对比结果（表1）显示：TST检出阳性114份，IFN-γ-ELISA检出阳性154份，符合率为72.7%，经SPSS分析，P＜0.05，说明IFN-γ-ELISA阳性检出率显著高于TST，表明其敏感性明显高于TST。