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穿心莲水提取物对大肠杆菌临床分离株的体外抑制试验唐 豪，郭慧琳
(甘肃省动物疫病预防控制中心，甘肃 兰州 730046)摘 要：试验用不同浓度的穿心莲水提取物对大肠杆菌临床分离株进行了体外抑制试验。制备含不同浓度穿心莲的培养基进行大肠杆菌培养，其中试验Ⅱ组、试验Ⅲ组、试验Ⅳ组和试验Ⅴ组培养基分别含不同浓度的穿心莲，试验Ⅰ组的培养基不加药作为对照。3 d后测量菌落直径，计算抑制率，并对数据进行方差分析和回归分析。结果表明，穿心莲对大肠杆菌具有抑制作用。各组之间均存在显著差异(P＜0.05)。其中试验Ⅰ组与试验Ⅳ组、试验Ⅴ组之间，试验Ⅱ组与试验Ⅴ组之间，试验Ⅲ组与试验Ⅴ组之间均差异极显著(P＜0.01)。剂量与抑制率之间的回归方程为：y＝1.672 9x＋2.778 6，R2＝0.992，其半数效应浓度EC50＝21.28 mg/mL。
关键词：穿心莲；大肠杆菌；体外抑制试验
穿心莲[Andrographis paniculata (Burm. f.)Nees]又名春莲秋柳、一见喜、榄核莲、苦胆草、金香草、金耳钩、印度草和苦草等，一年生草本，药用植物，具有解热、抗炎、抗病毒感染和免疫调节等作用[1-3]。在临床上，穿心莲主要用于治疗人或动物的肠道感染、呼吸道感染、皮肤疾病以及急性菌痢、胃肠炎、感冒发热和高血压等疾病；另外，穿心莲也可用于抗癌和抗生育等[4-10]。研究表明，穿心莲具有很高的体外抗菌活性，对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、甲型链球菌和乙型链球菌均有明显的抑菌作用[7]。为进一步确定穿心莲对致病性大肠杆菌的抑制作用，特进行本试验。
1 材料与方法
1.1 材料
药物：中药穿心莲购自本地医药公司。
菌株：鸡大肠杆菌菌株系本实验室从当地鸡场疑似病例中分离、鉴定和保存的优势菌株O78型大肠杆菌。
培养基的制备：普通LB肉汤和普通营养琼脂培养基均按常规方法配制。
1.2 方法
1.2.1 穿心莲水提取物制备
称取穿心莲200 g，清洗、浸泡后加 2 000 mL蒸馏水，文火煎煮1 h，保存滤液。分别加1 600 mL和800 mL蒸馏水进行第2次和第3次煎煮。合并3次滤液，加热浓缩到200 mL(生药浓度为 1 g/mL)，高压灭菌后4 ℃保存备用。
1.2.2 制备菌悬液
将大肠杆菌接种到肉汤培养基中，37 ℃恒温培养箱中培养24 h，调节菌液浓度为107 CFU/mL。
1.2.3 含药培养基的制备
按常规方法配制普通营养琼脂，按所需浓度加入不同体积的穿心莲水提取物，使各组培养基药物浓度分别为5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL和40 mg/mL，高压灭菌后，放置于超净工作台，待培养基冷却至40 ℃～50 ℃，倒入培养皿。
1.2.4 试验分组
试验设5组，每组设3个重复(n＝3)。试验Ⅰ组的培养基不含穿心莲水提取物，为空白对照组，试验Ⅱ组、试验Ⅲ组、试验Ⅳ组和试验Ⅴ组的培养基分别加入不同体积的穿心莲水提取物，使各组培养基含药浓度分别为5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL和40 mg/mL。
1.2.5 预试验
取1 mL菌悬液，用无菌生理盐水104倍稀释，然后取100 μL稀释菌液，均匀涂布于事先准备好的普通营养琼脂平板上，置37 ℃恒温培养箱中培养24 h后取出，置4 ℃冰箱备用。
1.2.6 抑菌试验
在无菌条件下，取预试验制备的大肠杆菌培养皿，选择一生长良好、边缘整齐且独立的圆形菌落，用直径5 mm的打孔器进行打孔，用镊子轻轻夹出菌饼并翻转，使长有菌落的一面朝下，对各试验组及对照组的培养皿进行接种，每组3个。接种后置于 37 ℃恒温培养箱中培养，3 d后用十字交叉法测量每组3个菌落直径，求平均值，并计算抑制率。抑制率计算公式如下：
2 结果与分析
穿心莲水提取物对大肠杆菌的抑制试验结果见表1，方差分析结果见表2。
由表2可见，F＝52.36＞F0.01，说明该试验的处理平均数间有统计学意义上的极显著差异(P＜0.01)。用最小显著差数法(LSD法)进行多重比较，结果见表3。
查t值表，当dfe＝10时，t0.05＝2.228，t0.01＝3.169。计算得：
由表3可见，试验Ⅰ组与试验Ⅳ组和试验Ⅴ组之间存在统计学意义上的极显著差异(P＜0.01)，与试验Ⅱ组和试验Ⅲ组存在统计学意义上的显著差异(P＜0.05)。试验Ⅱ组与试验Ⅴ组之间存在统计学意义上的极显著差异(P＜0.01)，与试验Ⅲ组和试验Ⅳ组之间存在统计学意义上的显著差异(P＜0.05)。试验Ⅲ组与试验Ⅴ组之间存在统计学意义上的极显著差异(P＜0.01)，与Ⅳ组存在统计学意义上的显著差异(P＜0.05)。
不同浓度药物对大肠杆菌的抑制率见表4。
由表4可见，穿心莲水提取物对大肠杆菌的抑制效果较好。培养3 d时，药液浓度为5 mg/mL时的抑制率仅为14.95％；随着药液浓度的逐步增加，抑制率也随之增加；当药液浓度达40 mg/mL时，抑制率达65.71％。
对抑制率数据进行回归分析，以其药液浓度的对数值为横坐标，抑制率概率值为纵坐标，得出穿心莲对大肠杆菌抑制率的回归曲线(图1)，其回归方程为：
y＝1.672 9x＋2.778 6
R2＝0.992
其半数效应浓度EC50＝21.28 mg/mL。
3 讨论
中药穿心莲植株的不同部位所含的活性成分不尽相同。穿心莲叶中的穿心莲甲素(去氧穿心莲内酯)、穿心莲乙素(穿心莲内酯)和穿心莲丙素(新穿心莲内酯)的含量分别为0.1％以上、1.5％以上和0.2％以上，还含有高穿心莲内酯、潘尼内酯、穿心莲烷、穿心莲酮、穿心莲甾醇和β-谷甾醇-D-葡萄糖甙等成分。穿心莲的根除含穿心莲内酯外，还含5-羟基-7,8,2',3'-四甲氧基黄酮、5-羟基-7,8,2'-三甲氧基黄酮、5,2'-二羟基-7,8-二甲氧基黄酮、芹菜素-7,4'-二甲醚和α-谷甾醇等成分。穿心莲的整棵植株含14-去氧-11-氧化穿心莲内酯和14-去氧-11,12-二去氢穿心莲内酯；另据初步分析，穿心莲还含甾醇皂甙、糖类及缩合鞣质等酚类物质。
在人医上，炎琥宁注射液和喜炎平注射液的主要成分均来自中药穿心莲，其中炎琥宁注射液的主要成分是14-脱羟-11,12-二脱氢穿心莲内酯-3,19-二琥珀酸半酯钾钠盐一水物，喜炎平注射液是由穿心莲内酯磺化物制成的中药注射剂。这提示穿心莲抗炎的有效成分是穿心莲内酯及其洐生物。据相关资料报道，炎琥宁注射液对急性咽炎有较好的治疗作用，其作用机制可能与调节细胞因子的表达和抑制咽部病理改变的发生有关。喜炎平注射液的主要成分是穿心莲内酯总酯磺化物，对感染性疾病特别是肺炎有治疗作用，作用机制为通过抑制炎性因子的释放使抗炎因子与促炎因子趋向平衡，从而达到合理的抗炎作用。利用像喜炎平注射液这类具有清热解毒作用的中药治疗感染性疾病时，并不在于中药能杀死多少种细菌或病毒，其更为重要的作用是阻断感染后的炎症反应，对机体进行免疫调节。也就是说，中药是在综合效应之下，达到与抗菌药物相同的治疗目的。在本次试验中，穿心莲对大肠杆菌具有明显的抑制效果，其机理尚有待进一步研究。
参考文献：(10篇，略)
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