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猪冷冻精液的生产制作与应用
现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2020/7/18 17:50:34 关注：646 评论： 我要投稿
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2020年初的新冠肺炎疫情，让还没有完全从非洲猪瘟中恢复过来的中国养猪业又遭遇重创，物资运输、人员交流受限，很多工作难以开展，特别是对中小规模猪场影响更大。中小规模生猪养殖是我国生猪产业的重要组成部分，他们的复养增养，既关系生猪生产恢复发展，又关系贫困地区通过发展产业带动贫困群众增收致富。当前，中小规模养殖场户迫切需要技术帮扶，提升养殖水平和生产效率，提振复养增养信心。
为贯彻落实全国畜牧业工作会议和农业农村部党组会议精神，按照农业农村部《加快生猪生产恢复发展三年行动方案》安排部署，加强科技支撑与指导服务，进一步提高中小养殖场户生猪饲养管理水平和疫病防控水平，全国畜牧总站近期开展了“生猪中小规模养殖实用技术大讲堂”线上直播。大讲堂结合中小规模猪场需求特点，授课专家全部来自生产一线，内容涉及生物安全防控管理、选种选配与公母猪饲养管理、增养复养案例介绍、猪场人员管理等。专家们用事实说话、用案例讲解，突出经验、做法的可借鉴性。生动且接地气，受到了广大养猪人的追捧。
6月9日下午15:00大讲堂第七期线上直播如期开始，全国畜牧总站邀请了北京田园奥瑞生物科技有限公司王相国博士针对当前热门的“猪冷冻精液技术”展开详细讲解，引发了养猪业同仁强烈关注，在线人数最高时达6万余人。
一、猪冷冻精液的历史与现状
首先我们来看一下猪冷冻精液的历史与现状，我将从国外和国内两条主线为大家简单讲述猪冷冻精液的研究历史。
国外
18世纪七八十年代，意大利学者开始研究哺乳动物的精液冷冻保存技术。1956年，英国的Ploge开始利用牛精液冷冻的方法进行猪冷冻精液保存技术的研究，其解冻后的精子具有活力，但是缺乏授精能力。1976年Ploge利用外科腹腔授精方法将解冻后的精子直接注入输卵管，获得了83%的受精率，并且得到了冻精生产的仔猪。1971年Pursel研究小组以常规的子宫颈输精法得到仔猪，并用干冰制作颗粒冻精。1975年Pursel和Westendorf分别以颗粒状和细管冷冻方法，成功冷冻保存公猪精液。1977年到1979年之间，美国、瑞士、法国、匈亚利、西班牙用冻精配种母猪达800～1000头，英国、澳大利亚用冻精配种母猪50～200头。2002年，瑞典用5ml平管冷冻猪精液并出口，冻后精子质膜完整率平均为60%，精子活力为49%-53%，受胎率73%,平均窝产仔数10.7头。
国内
我国从1950年代初期开始对猪精液冷冻技术进行探索。1975年在西安市草滩农场试配了8头母猪，有4头产仔,平均每窝8.9头。1977年成立了全国猪冻精协作组。在1975-1978年，全国利用猪冻精进行人工授精,累计配种母猪6079头,情期受胎率为42.1%～61.3%。截止到1986年，全国范围内冷冻精液累计配种母猪6万余头，情期受胎率达到70%以上，至此之后猪冷冻精液一直没有实现比较大的技术突破。
猪冷冻精液技术的研究方兴未艾。从2000年至今，西北农林科技大学李青旺教授，南京农业大学黄瑞华教授，北京农学院倪和民教授，重庆畜牧科学院潘红梅教老师等科研院所团队持续进行猪冷冻精液技术体系和试剂的研究，为我国培养了大量的猪冷冻精液方面的人才。
广东温氏集团较早自建冻精实验室，四川天兆猪业、河南鑫欣牧业等先后采用进口猪冷冻精液进行了育种工作。2016年，百钧达公司发布其猪冻精解冻后的活力能够达到74%~87%，“实现了猪冷冻精液的技术突破”，并且率先进行商品化的生产和应用。北京田园奥瑞生物科技有限公司与北京农学院倪和民教授团队自主研发的冻精设备、试剂相继取得成功，构建起完善的精液冷冻保存技术体系，实现80%以上的种公猪冷冻精液的解冻后精子活力≥70%，为猪冷冻精液商品化推广应用奠定了坚实的基础。
近年以来，上海祥欣、河南精旺、湖北襄大等种猪企业和大型养猪企业开始自主生产应用猪冷冻精液。上海祥欣2018年已经将种猪冷冻精液推广至国内16个省市，合计推广销售冻精112440支，配种1万余窝，平均受胎率达到85%左右，并首次将国产猪冷冻精液出口远销到俄罗斯。湖北襄大畜牧集团2018年先后采用猪冷冻精液配种4000余头母猪，情期受胎率达到90%以上，产仔数达到12头左右，接近常温精液繁殖水平。2019年10月，湖北襄大建立冻精实验室自主生产猪冷冻精液。南京农业大学黄瑞华教授团队与北京田园奥瑞合作建立猪冻精实验室，开展地方品种猪冷冻精液研究，2019年抢救性地制作完成金华两头乌、二花脸、苏淮猪等十多个品种120多头地方品种约4万支合格的冷冻精液，为避免个别地方品种猪遭受非洲猪瘟的灭顶之灾发挥重要作用。贵州省纳雍县畜牧工作站2018年、2019年连续举办猪冷冻精液技术讲座，引入河南精旺优秀的种公猪冷冻精液与当地地方品种猪进行杂交配种试验，成功受孕并产仔。使用冷冻精液极大地降低了市县畜牧工作站的引种成本，同时也极大的减少了非洲猪瘟等疫情期间病毒传播的风险。
二、猪冷冻精液的特点和优势
猪冷冻精液技术是指利用液氮等作冷却源，将精液特殊处理后，保存在超低温的液氮（-196℃）状态下，达到长期保存的一种技术。目前，猪的鲜精保存技术已经广泛地应用到养猪生产实践中，该项技术为猪冷冻精液技术推广应用奠定了坚实的前期基础。
猪冷冻精液有其特点与优势，可以补足常温精液繁殖短板。
首先我们知道常温精液在15℃～17℃ 的环境中只能保存5-10天，而且它会由于公猪的饲养量、疫情的影响造成大面积的供求差异。如果我们使用冷冻精液，就可以实现在液氮中的长期保存。而且目前来说没有一个时间限制，就是保存多久，它解冻之后的活力都不会影响太多，都不受时间的影响，不受季节的影响，它可以有效的平衡淡旺季的精液需求，保障情期的授精。
使用常温精液育种，会发生随着优秀种公猪繁殖能力下降和淘汰，育种水平也同时出现降低和停滞的现象，导致最终育种水平发展缓慢。如果我们使用冷冻精液，就可以持续高效的生产、保存、运输，充分挖掘优良种猪的繁殖潜力，扩大高育种值公猪精液的覆盖范围，那么就可以有效的提高我们的育种水平，扩大了高育种值公猪精液的覆盖范围，快速提高育种水平，提高优秀种公猪利用率。
常温精液在15℃~17℃左右的保存过程中的储存、运输特别容易受到不同的条件、气温、地域差异的影响。冷冻精液在液氮中储存，避免了冷、热应激对精子的伤害且不受季节、交通等突变因素影响。
常温精液由于保存、运输受到地域的限制，极大的限制了在我国这样幅员辽阔的国家里的使用。而如果我们使用冷冻精液，那么它的保存、运输不受时间、地域和季节的影响，可以抵达我国各个地域进行使用。
在我们的养殖过程当中特别担心疫病的问题，尤其是非洲猪瘟流行以来，这种病毒可以伴随着常温精液输精传播。如果我们使用冷冻精液，那么在种公猪的选择、采精以及精液的制作过程和精液保存期间，还有多个检测的窗口期，可以进行多项安全性的检测以及遗传性能的测定，充分隔绝疫病的传播风险。
我们使用常温精液还有一个非常重要的一个因素，就是种公猪的饲养。我们知道一头种公猪的饲养成本大约每年是在1万元左右，如果我们使用冷冻精液就可以极大的降低种公猪的饲养数量，扩大种公猪的选择基础数量。随着种公猪饲养群体数量的变小，就有利于饲养管理精细化的操作和疫病的防控，最终降低引种和饲养管理成本，这对我们中小规模的养猪企业来说至关重要。
三、猪冷冻精液制作技术
猪冷冻精液制作需要一定的技术、设备和冷冻精液试剂，还有一定的操作流程，来实现我们的长期保存。在猪冷冻精液的生产制作过程中，从采精、预稀释、离心、稀释平衡、灌装、冷冻和保存等各个关键步骤中，它都有其特性。
3.1主要仪器设备。
3.1.1精子质量分析系统。用于检测分析精液质量，包含精子密度、精子活力、精子畸形率等，评估精子质量是否达到制作冷冻精液标准，以及冷冻后的冷冻精液质量是否达到繁殖配种要求。
3.1.2 离心机。用于分离精液中的精子和精清，以达到冷冻精液所需要的密度。由于猪精液量比较多，建议使用猪精液专用大容量离心机。
3.1.3 程控平衡仪。设置降温温度、速度、时间等程序，精准控制降温速率，保障按照预定时间降温到预定温度。
3.1.4 细管灌装机。用于把精液灌装于0.5ml细管内，通常为全自动细管灌装封口一体机。
3.1.5 细管喷码机。用于精液细管喷码，标记猪冷冻精液的相关品种、来源和生产日期等商品参数。
3.1.6 程控冷冻仪。设置降温温度、速度、时间等程序，精准控制降温速率，最大程度地保护精子在冷冻过程中免受损伤。
3.2 猪冻精试剂。
猪冷冻精液质量的好与坏，猪冻精试剂的配置是非常重要的一个因素。冻精试剂一般含有预稀释剂、冷藏保护剂（通常称为Ⅰ液）、冷冻保护剂（通常称为Ⅱ液）和解冻剂四大组成部分。以TYP-5田园奥瑞猪冻精试剂为例，TYP-5含有5组成分，分别是：试剂A-预稀释剂、试剂B-基础营养液、试剂C-冷冻辅助剂I、试剂D-冷冻辅助剂II、试剂E-解冻剂，配制使用方法如下。
3.2.1 预稀释剂。直接使用试剂A-预稀释剂，一共有A1、A2两小包，同时溶于1L双蒸水，在37°C水浴锅中备用。采完精液之后，按照1：1进行预稀释，为精子的储能做准备。
3.2.2 冷藏保护剂（Ⅰ液）：将试剂B-基础营养液用400mL双蒸水中进行充分的溶解，按照4:1的比例加入蛋黄，制作成冷藏保护剂（Ⅰ液），放置在17°C恒温冰箱备用。
3.2.3 冷冻保护剂（Ⅱ液）：将试剂C-冷冻辅助剂I、试剂D-冷冻辅助剂II分别加入276mL冷藏保护剂（Ⅰ液），制成冷冻保护剂（Ⅱ液），放置在4°C恒温冰箱备用。
3.2.4 解冻剂：直接使用试剂E-解冻剂,1g溶于20 mL双蒸水，4℃备用。
3.3 猪冷冻精液生产制作操作流程。
猪冷冻精液生产制作几个关键的步骤，包括精液采集、精液质量分析检测，精液预稀释、17°C平衡、精液离心，4°C平衡，加冷冻保护剂灌装封口，然后进行冷冻和保存。保存前需要进行冷冻精液的质量检测。
3.3.1 精液采集。首先要按国家标准选择种公猪，选择经过鉴定并列入正式名录的公猪。在采集过程中，要戴干净卫生的一次性手套，采集富含精子的射精中段部分75~125毫升，前后两段的射精部分应该舍弃。整个采集过程要操作规范，采精频率要合理，避免更换采精员，确保精液品质优良。
3.3.2 精液质量检测。对于采集的精液的首先需要进行精液质量检测。包括精子的活力、精子的密度以及畸形率等，对于制作冷冻精液的精液质量要求要比常规的精液质量要求略高，要求精子的活力≥80%，精子密度≥1亿/ml，精子畸形率≤10%。
3.3.3 精液预稀释。精液采集完成后，经过质量检验合格适宜进行冷冻的精液，使用已经35°C左右预热的预稀释液与精液按照1:1的比例进行稀释混合摇匀。在混合之前要做一个测温，精液与预稀释液温度差异不能超过一度。预稀释后的精液在室温（25°C左右）环境下静置约1小时，以避免精子快速降温导致损伤。预稀释过程大部分是在猪场进行，采集精液并完成预稀释后，尽快用泡沫箱将它运送到冻精实验室进行后期处理。
3.3.4 17℃平衡。经预稀释的精液室温静置1小时后，转入到17℃恒温箱中进行平衡降温，平衡时间2~3个小时，最长不超过24个小时。如果有平衡仪，稀释后可以直接放准备好的平衡仪里进行降温，按照设置好的曲线从精液当前温度（34℃左右）平衡到17℃。
3.3.5 精液离心。精液离心之前的准备工作：首先对离心瓶称重并记录数据W0，然后把离心瓶进行17℃预冷。精液经过17℃平衡2~3小时后，装入已经预冷的离心瓶进行称重配平，17℃条件下800g离心10分钟。离心完毕，将离心瓶从离心机中取出，用精液抽吸泵祛除上清液。抽吸祛除完上清液，对装有沉淀精子的离心瓶称重，记录数据W1，减去原来空离心瓶的质量W0，得出精液的体积并记录数据为V1。
3.3.5 4℃平衡。将17℃预冷的冷藏保护剂（Ⅰ液）加注到离心之后的精子进行重悬。加Ⅰ液的体积，要我们根据采精时测算的总精子数和我们所要做成的每支细管的目标精子数进行计算，其公式为V2=总精子数（亿）/目标精子数（亿/mL）-V1（mL）。加完Ⅰ液之后，把它放入有17°C水的烧杯中，与烧杯一起置入4℃冰箱降温平衡2.5-3h至4~5℃，有程控平衡仪的放程控平衡仪降温。降温到4~5℃后继续平衡0.5~1个小时。
3.3.6 细管灌装。精液在4摄氏度平衡后，加入II液，稀释一倍，其体积V3=V1+V2，达到分装的精子密度10亿/mL。加入II液稀释混匀后，立即在低温操作柜中进行0.5 mL细管灌装，细管喷码要准确标记精液的品种、来源猪场、公猪耳号、生产日期等信息。灌装完成后，按不同猪号分类码放在细管托架。
3.3.7 精液冷冻。冷冻前检查液氮增压罐和程控冷冻仪，确认液氮充足压力正常，设置或调用猪冷冻精液专用冷冻降温曲线，参考曲线为。
在精液灌装的同时开启程序冷冻仪，将冷冻室温度降到初始温度4-5℃。待冷冻仪温度稳定在初始温度后，打开冷冻室盖子，迅速将码好冷冻精液细管的托架放入冷冻腔室中，开始冷冻程序。待冷冻曲线走完后，将托架迅速取出放入装有液氮的泡沫箱中，液氮深度至少浸没所有细管。注意不同猪号的冻精，要放入不同的泡沫箱，以避免混淆。一般公猪一次采精量可制作0.5mL细管的冷冻精液100余支，常用的程控冷冻仪一般每批次可以冷冻1000支左右，如果紧接着进行第二批次冷冻，必须把程控冷冻仪腔室烘干，并再次检查增压罐里的液氮是否充足。
3.3.8冻精检测。冻存前的冷冻精液需要进行解冻检测，确保冷冻精液质量达到保存要求。常用的解冻方式为50℃的水温中解冻16秒，解冻后加入预热37℃的解冻剂中，摇匀后取中段精液进行观察检测。要求解冻后精子活力≥60%，精子畸形率≤20%等。
3.3.9冻精保存。经解冻检测合格的冷冻精液分装到无菌纱布袋，核对冷冻精液细管标记信息，一个纱布袋不要混装不同猪号的冷冻精液。分装完成后，要给纱布袋做好标签标记。液氮罐里的冷冻精液纱布袋应完全浸没在液氮里，并定期检查液氮罐保存情况，适时加注液氮。
四、猪冷冻精液的应用
4.1 解冻与输精
1、设备试剂准备。准备好两个水浴锅预热，50℃用于解冻，30℃用于预热解冻剂。解冻剂配制好后充分混匀，分装到输精瓶中预热26~32℃备用。
2、根据猪场发情母猪的数量和配种的需求量，从液氮中快速取出所需要冻精的品种和数量，在空气中停留不超过5秒，快速移入50℃水浴锅中解冻16秒，解冻取出后迅速擦干冻精细管上的粘留的水分。
3、将解冻好的精液两端剪掉，注入到提前预热的输精瓶中。轻轻的上下摇晃至少两次，以充分混匀，不留沉淀，以备输精。
3、将解冻好的冻精在30分钟内进行子宫深部输精，建议一个输精剂量有效精子总数不低于同等条件下的常温精液。
4.2 冷冻精液在中小规模猪场中的应用
中小规模猪场是我国养猪业重要组成部分，但是在实际生产实践中面临很多问题：自己育种不现实，引种麻烦；公猪引种昂贵；种公猪圈舍建设、饲喂、管理成本较高；频繁进出猪场带来了生物安全隐患。
应用冷冻精液可以解决许多的问题。
从降本增效上来讲，可以有效的提高种公猪的利用率，降低引种和饲养管理成本，提高生产效率；从使用的范围上来说，由于冻精的运输方便，还不受地域、季节、交通等因素的限制，可以扩大优秀种公猪的使用范围；使用猪冻精，还可以解决优良公猪的衰老、淘汰所导致的育种强度的停滞和缓慢，使优良基因的选择更多元，育种强度更高；冷冻精液买来之后，一次储存可以随时解冻、随时使用，以平衡供需不同步的矛盾，保障情期授精；冷冻精液在种公猪选择、精液制作过程、保存期间有多个检测窗口，同时一次购买，长期使用，可以有效的减少我们疫病传播的风险。
4.3 展望
展望冷冻精液的未来，目前发情鉴定和深部输精等人工授精配套技术体系日趋完善，在保证受胎率和产仔数的前提下，使用冷冻精液一次输精量有望减少到的10-15亿/次，甚至减少到4-8亿/次，进一步提高优秀种公猪的使用效率，减少种公猪的数量。
猪冷冻精液使用方便、经济高效，未来将进一步得到推广和普及，现今牛冷冻精液的景象，就是猪冷冻精液的明天！
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| 文章来源：中国畜牧业 文章作者：王相国博士 文章编辑：一米优讯 |
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