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副猪嗜血杆菌的实验室检测技术
现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2020/10/5 21:46:09 关注：675 评论： 我要投稿
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摘要：副猪嗜血杆菌病发病率和死亡率较高，给养猪业造成了严重损失。为及时确诊该病，本文从细菌分离鉴定、血清学检测和分子生物学检测3个方面，对副猪嗜血杆菌实验室诊断方法的研究进展及其优缺点进行了综述。细菌分离鉴定特异性较强，但操作复杂、用时长、所需仪器多，无法满足快速检测需求；酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接血凝试验（IHA）和补体结合试验（CF）3种血清学检测方法操作简便、快速，但特异性和敏感性不高，主要适用于早期诊断和筛查。近年来，分子生物技术快速发展，已建立了PCR、荧光定量PCR、数字PCR和环介导等温扩增（LAMP）等多种分子生物学检测方法。这些分子生物学检测方法敏感、快速、特异和稳定，其中PCR、荧光定量PCR已广泛应用于实践中，而数字PCR和LAMP检测技术尚需进一步优化。多种特异性好、灵敏度高、重复性好、检测快速的实验室检测方法的建立和改进，为副猪嗜血杆菌病检测和流行病学调查提供了有效的技术支撑。
副猪嗜血杆菌（haemophilus parasuis，HPS）可引起以猪纤维素性多发性浆膜炎、脑膜炎和关节炎为特征的副猪嗜血杆菌病，也称为猪革拉瑟氏病（glasser's disease，属于多发性全身性疾病）。HPS属于革兰氏阴性菌，隶属于巴斯德菌科嗜血杆菌属，是一种NAD依赖型、不运动的细小杆菌。HPS是一种条件性致病菌，正常存在于常规猪群上呼吸道中，在猪抵抗力低下或对环境耐受减弱时，可侵入机体各器官引起发病。HPS主要危害2周龄至4月龄的猪群，尤其对保育期和断奶前后仔猪危害严重，发病率为10%~15%，病死率可高达50%，给养猪业造成严重经济损失。
近年来，副猪嗜血杆菌病在我国流行日趋严重，在四川、河北、湖南、湖北、宁夏、广东等多个省（自治区）均有发生。副猪嗜血杆菌病防控的关键在于及时确诊并采取相应的防治措施。临床上可根据发病猪群的病史、临床症状和剖检病理变化以及该病的流行病学特点作出初步诊断，然后再进行实验室检测以确诊。目前，副猪嗜血杆菌病常用的实验室诊断方法有细菌分离鉴定、血清学检测和分子生物学检测。本文对副猪嗜血杆菌病的诊断方法进行全面综述，以期为该病防控提供参考。
细菌分离鉴定
HPS生长要求条件较高，培养较为困难，通常选择含有血清和NAD的TSA、TSB培养基或巧克力琼脂培养基进行培养。该菌非常脆弱，在外界环境中很容易死亡，所以HPS的成功分离培养常作为鉴定副猪嗜血杆菌病的标准。细菌分离鉴定时的病料应采集于未经抗生素治疗过的急性期病猪，主要包括肺脏、淋巴结、关节液、心包液和脑脊液等。仅从鼻腔、扁桃体和气管中分离出细菌无法评估疾病是由HPS引起的。采集的病料应尽快送实验室检测，一般不得超过24h。利用添加了血清和NAD的TSA培养基纯化分离菌株时，挑取单个无色透明、针尖大小，呈圆形、边缘整齐、光滑湿润的可疑菌落涂片后进行革兰氏染色，镜检观察是否为革兰氏阴性短小杆菌。挑取上述可疑菌落水平划线接种于不含NAD的鲜血平板上，然后用金黄色葡萄球菌垂直划线接种培养48h，观察是否出现“卫星生长”现象。挑取上述可疑菌落进行生化试验鉴定，包括葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、尿素酶、甘露醇和硝酸盐（还原）等。综合菌落形态、细菌染色镜检形态和生化试验结果可确诊。
细菌分离鉴定不足之处在于操作复杂，用时较长，所需试剂盒仪器较多，无法满足快速检测的要求。尽管细菌分离鉴定有很多不足之处，但是该方法特异性较强，在细菌培养过程中能够发现共同感染的其他病原微生物，而且细菌分离鉴定是其他实验室检测方法的基础。
血清学检测
血清学检测技术主要是利用抗原抗体的特异性结合，对样本中抗原或抗体进行定性和定量的一种分析检测方法。目前血清学检测技术很多，其中酶联免疫吸附试验（enzyme labeled immunosorbent assay，ELISA），间接血凝试验（indirect hemagglutination assay，IHA）和补体结合试验（complement fixation test，CF）是比较常见的HPS血清学检测技术。
郑新添等以HPS外膜蛋白Omp16为包被抗原，建立了检测HPS的间接ELISA方法。该方法特异性强、敏感性高、重复性好，与进口商品化试剂盒有较高的一致性。石保秋用HPS的细胞致死膨胀素（cytolethal distending toxin，CDT）中一个免疫原性最好的C亚基（CdtC蛋白）作为包被抗原，建立了HPS间接ELISA检测方法。该方法重复性好，无交叉反应，敏感性高（100%）、特异性好（92.9%）。王正皓通过原核表达和纯化HPS的YfeA蛋白，构建了基于该蛋白的抗体检测间接ELISA方法。该方法具有良好的重复性、特异性和稳定性，与进口商品化试剂盒的阳性和阴性符合率较高。朱晓明等以锰依赖的超氧化物歧化酶（manganese-dependent superoxide dismutase，MSD）作为包被抗原，建立了HPS间接ELISA检测方法，但该方法只能保证对HPS的4、5和12血清型进行准确检测。石碧等提取了HPS血清5型菌株的荚膜多糖（capsular polysaccharide，CPS），并以其为抗原分别建立了IHA和间接ELISA两种抗体检测方法。两种检测方法的特异性都很好，但ELISA检测方法敏感性是IHA的5~10倍。徐引弟等选用HPS的4、5和13型3种血清型为抗原，建立了一种检测HPS抗体的IHA检测方法。该方法敏感性较琼脂扩散试验高，但特异性不太强，仍然将胸膜肺炎放线杆菌检测为阳性。
与IHA和CF方法相比，ELISA检测方法特异性强、敏感性高、稳定性高，而且具有稳定、简单、特异、快速、灵敏和易于自动化操作等优点，而且1d内能够检测几百甚至上千份样本，是一种良好的早期诊断方法。
分子生物学检测
由于HPS在外界环境中容易死亡，且生长条件苛刻，所以临床上很难通过病原分离来确诊，血清学检测也存在一定的不确定性，而分子生物学检测方法的引入大幅提高了诊断的准确性。近年来，随着分子生物技术的快速发展，针对HPS核酸建立了多种检测方法，例如聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR），荧光定量PCR技术，数字PCR技术和环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等。
普通PCR技术
马超锋等根据GenBank中HPS的16S rRNA基因保守区序列设计了1对特异性引物，构建了检测HPS的PCR方法。该方法敏感、快速、特异，对于病原的最小检出量为7.2×10-6?g/mL，可用于临床上HPS感染的快速检测。梁乔等根据HPS的infB基因序列设计合成1对特异性引物，建立了一种针对HPS的PCR鉴别诊断方法。该方法灵敏度高、特异性强，与其他细菌无交叉反应，能检测到的最低DNA浓度为18.1×10-6?g/mL，可用于HPS的实验室诊断。万世平等针对HPS的16S rRNA基因设计1对引物，建立了一种能够快速检测HPS的PCR方法。该方法最低检出量达10-3ng，且与其他细菌无交叉反应。
除了单独检测HPS的PCR方法，还有能同时检测多种病原的多重PCR方法。朱新贵等根据GenBank中HPS的16S rRNA、PILA、LIPO基因保守序列和猪多杀性巴氏杆菌的16S rRNA、KMT1基因保守序列，同时建立了双重及多重PCR检测方法。所建立的双重及多重PCR检测方法具有准确度高、特异性强、快速的优点，可用于HPS和猪多杀性巴氏杆菌的临床快速诊断。任梅渗等根据HPS、猪多杀性巴氏杆菌、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和胸膜肺炎放线杆菌标准毒株序列，以及各病毒和细菌的保守序列，分别设计7对特异性引物，建立了能够同时检测导致猪呼吸道综合征疾病的7种病原的多重PCR方法。该方法灵敏、快捷、特异，能检测出病原的多种血清型，为上述7种病原的临床诊断和流行病学研究提供了技术支撑。
PCR检测技术无须进行病原菌的分离培养，只需从病料中提取DNA，利用特异性引物进行PCR扩增获取目的片段就可以作出诊断。PCR检测技术具有灵敏度高、特异性强和检测速度快等优点，几个小时内就可以获得检测结果，很大程度上缩短了病原检测时间。
荧光定量PCR技术
于江等根据GenBank中的HPS infB基因序列设计1对特异性引物，建立了一种检测HPS的荧光定量PCR检测技术。该方法对HPS具有良好的特异性，不与其他猪源细菌发生交叉反应，敏感性比普通PCR高100倍，而且非常稳定，重复性较好，批间与批内重复试验变异系数均小于2.5%。本方法的建立满足了HPS快速诊断和定量检测的需求。苗立中等根据GenBank中HPS infB基因序列设计特异性引物，构建了一种快速检测HPS的实时荧光定量PCR方法。该方法敏感性达10copies/μL，比普通PCR高100倍，重复性较好，重复性试验变异系数均小于2.5%，同时对HPS具有良好的特异性，与其他病原均无交叉反应，可用于临床上HPS的快速诊断和定量检测。崔沛等根据GenBank中HPS的16S rRNA基因序列设计1对特异性引物和1条特异性TaqMan-MGB探针，建立了一种检测HPS的荧光定量PCR方法。该方法稳定性强、特异性好、敏感性高，适用于临床上HPS感染的早期检测，对HPS的快速诊断和综合防控均有重要意义。庞琳琳等根据GenBank中HPS不同血清型的保守区设计引物，建立了一种检测HPS的荧光定量PCR方法。该方法具有较高的重复性、特异性和敏感性，组内差异性小于2.5%，组间差异性小于4%，敏感性是普通PCR的100倍，适用于HPS感染的早期诊断和流行病学调查。
采用荧光定量PCR方法也可以实现同时检测多种病原。姜睿姣等根据HPS的OmpP2基因序列和多杀性巴氏杆菌的PlpE基因序列分别设计了特异性引物和探针，建立了一种能同时检测HPS和多杀性巴氏杆菌的双重荧光定量PCR方法。该方法和单一荧光定量PCR最低检测限相同，对HPS及多杀性巴氏杆菌重组质粒标准品的最低检测浓度分别为5.60×10-2和7.58×10-2copies/μL，是常规PCR的100倍，组内和组间变异系数均小于2.5%，能够用于这两种疾病的同时检测。
荧光定量PCR技术的灵敏度比普通PCR提高了100倍，很大程度上减少了假阳性概率，检测结果判断不用借助电泳分析，不但减少了溴化乙锭等核酸染料对试验人员身体的致癌危害和环境污染，而且还缩短了检测时间，检测结果更直观，因而是一种安全且快速的诊断方法。
数字PCR技术
数字PCR技术是近年发展起来的第3代PCR技术。它的原理是将预混的PCR反应体系进行微滴化处理，形成几万至几十万个油包水的液化微滴，使每个微滴中只有1个或不含有核酸模板，经PCR扩增后，荧光检测每个微滴中的阳性微滴数和阴性微滴数，然后根据泊松公布原理即可计算出核酸模板的初始拷贝数。
石磊等参考HPS OmpP2基因的保守序列设计了特异性引物和TaqMan探针，建立了一种能对HPS准确定量的微滴数字PCR检测方法。该方法与其他猪源的病原微生物均无交叉反应，阳性质粒的最低检测浓度可达到2.647 copies/μL，与实时荧光定量PCR方法相比，灵敏度和实际检出率均有一定程度提高。该方法重复性好、灵敏度高、特异性强，可用于HPS低含量样品检测和定量检测。数字PCR的建立为HPS检测和流行病学调查提供了另外一种切实可行的方法。
与实时荧光定量PCR技术相比，数字PCR技术具有精准、灵敏度超高和不易受PCR抑制物影响等优点。这可能是因为数字PCR技术直接计算目标分子数而不依赖任何校准物或者外标，直接通过计算单个分子实现绝对定量。但是数字PCR技术也存在一些不足，比如：检测所需时间较长，是实时荧光定量PCR技术的2~3倍；检测样本需要稀释到一定浓度才可检测；单个样本检测成本高于实时荧光定量PCR技术，所需仪器设备昂贵。
LAMP技术
LAMP技术是一种新型的核酸扩增技术。该技术主要利用BstDNA聚合酶的链置换作用进行DNA扩增，需选取靶基因上6个特定的区域设计4条特异性引物，所以LAMP技术引起非特异性扩增的概率极小，特异性较强。LAMP技术敏感性较高，而且反应所需时间较短，在恒温条件下1h之内即可完成，扩增量可达到1010倍。另外，LAMP技术的反应结果便于观察，适用于临床上的快速检测。
车勇良等参考GenBank中HPS的肽聚糖相关脂蛋白（peptidoglycan associated lipoprotein，PalA）基因序列，在其保守区域设计引物，建立了一种HPS可视化LAMP检测方法。该方法的DNA最小检测限为40fg，敏感度较高，是普通PCR检测方法的100倍；整个检测反应只需要在55℃水浴1h即可；反应结束后只需向反应液中加入荧光染料，通过肉眼就能辨别检测结果。该方法检测快速、简便，适合在养殖场和兽医基层推广使用。刘亚娟等根据GenBank中HPS的16S rRNA基因序列设计6条引物，建立了一种检测HPS的LAMP方法。该方法仅需在65℃下反应15min，便能实现肉眼可视化直接判定结果，并且具有较高的灵敏度，最低DNA可检测浓度为0.175fg/?L，比普通PCR高104倍，重复性和稳定性均在95%以上，对可疑临床样品检测的准确率为100%，适用于养殖场和基层的HPS快速鉴别诊断。
采用LAMP检测方法也可以实现同时检测多种病原。刘博婷等根据HPS的infB基因和猪链球菌2 型的Cps2j基因分别设计1套LAMP引物，建立了能够同时检测HPS和猪链球菌的双重LAMP检测方法。该方法的灵敏度较常规PCR提高了两个数量级，而且与其他病原菌无交叉反应。采用普通PCR方法和该双重LAMP方法同时对同一批临床样本进行检测，检出率分别为17.0%和31.0%。这说明该双重LAMP方法具有良好的灵敏度和特异性，可实现两种病原的同步快速检测，对临床上这两种病原共同感染的检测有很大帮助。
到目前为止，LAMP技术是检测HPS所需时间最短的一种检测方法，且灵敏度高于PCR技术，一般是PCR技术的102~104倍。LAMP技术具有所需设备简单、特异性强、灵敏度高、反应迅速、操作简单、产物检测方便等优点，但也存在一些不足，比如引物设计和筛选难度大，因灵敏度高易出现假阳性等。
小结与展望
目前，副猪嗜血杆菌病的实验室检测方法正由传统的细菌分离鉴定转向血清学检测和分子生物学检测等更加快速、简单和精确的方法。由于细菌分离鉴定耗时较长，无法满足快速检测需求，所以细菌分离鉴定在临床诊断上的应用受到一定的限制。IHA、CF和ELISA等血清学检测方法操作简便、快速，但由于其特异性和敏感性不高，主要适用于猪群的群体筛查。与细菌分离鉴定和血清学鉴定等检测方法相比，分子生物学检测方法具有快速、特异、敏感和稳定等优点，且在混合感染检测上更有优势，尤其是普通PCR检测技术和荧光定量PCR检测技术已经广泛应用到副猪嗜血杆菌病的临床检测。因数字PCR检测技术检测所需时间较普通PCR和荧光定量PCR长，LAMP 检测技术所需引物设计和筛选难度大，所以这两种分子生物学检测方法在临床诊断上还未得到广泛推广。在未来，数字PCR检测技术和LAMP检测技术还需进一步优化。各种特异性好、灵敏度高、重复性好和快速的实验室检测方法的建立和改进，对疫苗免疫后的抗体水平检测和流行病学调查提供了有效的帮助，在指导副猪嗜血杆菌病的防控上具有重要意义。
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| 文章作者：曾泽 等 中国动物检疫 文章编辑：一米优讯 |
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