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酵母培养物对山羊亚急性瘤胃酸中毒体外发酵模型的调控作用


现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2020/10/13 11:01:18 关注:183 评论: 我要投稿

  摘 要:本试验旨在探究酵母培养物(YC)对山羊亚急性瘤胃酸中毒外发酵模型的调控作用。采用体外批次培养法,在不同非纤维性碳水化合物(NFC)/中性洗涤纤维(NDF)[1.19(常规底物)和2.30(高NFC底物)]的底物中分别添加6个水平[0(对照)、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%]的YC,探究其对瘤胃发酵参数的影响,并用多项指标综合指数(MFAEI)进行评定,筛选出在不同NFC/NDF条件下最适YC添加水平。结果表明:1)在高NFC底物条件下,发酵液pH低于5.8时长超过3h,体外亚急性瘤胃酸中毒模型建立成功;且添加YC能够稳定9~12h的pH,显著降低12和24h乳酸含量(P<0.05),显著降低9和12h氨态氮(NH3-N)含量(P<0.05),显著提高12h微生物蛋白(MCP)含量(P<0.05),显著提高3、6、12、24h乙酸百分比(P<0.05),显著提高24h总挥发性脂肪酸(TVFA)含量(P<0.05)。2)在常规底物条件下,YC能稳定瘤胃发酵液24h的pH,显著降低12h乳酸含量(P<0.05),显著提高9h的NH3-N含量、6和12hMCP含量及3~24hTVFA含量(P<0.05)。3)MFAEI结果表明,常规底物条件下,以1.5%的YC添加水平对体外发酵作用效果最佳;高NFC底物条件下,以2.0%的YC添加水平对亚急性瘤胃酸中毒的缓解作用最佳。因此,在高NFC底物条件下添加YC的作用效果更好,能通过降低发酵液中乳酸含量达到调控瘤胃发酵液pH的效果,具有缓解亚急性瘤胃酸中毒的潜力。
  我国优质粗饲料资源缺乏,为满足生产需要许多养殖者通过在反刍动物饲粮中添加高精料以满足动物的营养需要,但高精料的过度摄入会导致动物发生亚急性瘤胃酸中毒(subacute rumen acidosis,SARA)。SARA的产生不仅给我国反刍动物养殖业带来了很巨大的损失,而且也是阻碍我国反刍动物发展的主要阻力之一。近年来,许多学者都致力于寻找一种能高效、无副作用缓解瘤胃酸中毒的方法,现有的缓解瘤胃酸中毒症状的方法有:添加缓冲剂、接种乳酸利用菌、添加有机酸、添加硫胺素、接种疫苗。这些方法虽在一定程度上能够缓解瘤胃酸中毒所带来的经济损失,但是也均存在一定的弊端,不能从根本上解决瘤胃酸中毒这个问题。酵母培养物(yeast culture,YC)作为一种微生物发酵产物添加剂,有望通过调节瘤胃微生物区系的稳定来达到调控瘤胃酸中毒的效果。
  YC是由酵母菌在特定培养基上经过特定的制作工艺发酵而成的一种微生物添加剂,其中富含维生素B、微量元素、未知营养因子、霉菌吸附剂寡糖、消化酶、氨基酸、有机酸和碳水化合物。近年来,YC作为一种微生物添加剂已经在反刍动物生产中广泛应用,能够改善瘤胃发酵模式和提高动物生产性能。有研究表明,YC可以通过减少乳酸的产生、增加瘤胃微生物对乳酸的利用量而稳定瘤胃pH。但也有研究表明,YC对瘤胃pH没有显著影响,但能够降低瘤胃内的乳酸含量。YC对反刍动物作用的效果受菌株种类、饲粮类型、活菌含量等多种因素影响,体内、外试验结果也不尽相同。因此,本试验以萨能山羊为试验动物,通过体外批次培养法,探讨在不同非纤维性碳水化合物(NFC)/中性洗涤纤维(NDF)底物条件下添加不同水平的YC对由高NFC饲粮诱发的SARA的调控作用,为YC在山羊生产中的应用提供参考。
  1材料与方法
  1.1 试验动物及饲粮
  选取3只体重相近、安装有永久性瘤胃瘘管的健康萨能山羊作为体外发酵瘤胃液的供体,饲粮组成及营养水平如表1所示。试验所用YC是由湖北某酵母股份有限公司提供,经酿酒酵母菌属发酵而成的,其成分为:酵母活细胞数≥2亿个/g,粗蛋白质含量≥20%,甘露寡糖含量≥10%,水分含量≤8%。试验动物每日饲喂2次(07:00和19:00),单栏饲养,自由饮水,试验在扬州大学动物科技学院动物房进行。

  1.2 试验设计
  试验为单因素试验设计,在不同NFC/NDF[1.19(常规底物)和2.30(高NFC底物)]的底物中分别添加6个水平[0(对照)、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%]的YC,采用体外批次培养法探究其对瘤胃发酵参数的影响。
  1.3 瘤胃液的采集
  试验当天于晨饲前进行瘤胃液的采集,采用自制真空负压装置采集山羊瘤胃前、中、后3个不同部位的瘤胃液,之后迅速混匀经4层纱布过滤,装入提前预热且充满二氧化碳(CO2)的保温瓶中迅速带回实验室,于38℃恒温水浴锅中保温,并持续通以CO2。
  1.4 体外发酵液与底物的配制
  试验选用半纯合饲粮为发酵底物,底物组成如表2所示;试验所用人工唾液,参照Leedle等的方法配制而成,将配制好的人工唾液放入水浴锅中水浴至38℃并持续通入CO2备用。将60mL瘤胃液和人工唾液的混合液(瘤胃液∶人工唾液=1∶2)分装至厌氧培养瓶中,分装时向发酵瓶中通5s以上CO2以排除空气,分装完毕迅速加盖异丁基塑胶塞,并以黑色塑料旋拧盖固定密封,置于38℃恒温水浴摇床中进行培养。每个时间点每组设置3个重复,分别于培养后的3、6、9、12、24h采集发酵液,用于测定各发酵参数。

  1.5 发酵参数测定方法
  发酵液pH选用pHS-3C型pH计进行测定;氨态氮(NH3-N)含量参考Broderick等的苯酚-次氯酸钠比色法进行测定;挥发性脂肪酸(VFAs)含量参照Kawamoto等和Khan等的气相色谱法,用日本津岛公司生产的GC-9A气相色谱仪进行测定;微生物蛋白(MCP)含量参照嘌呤法,用紫外分光光度计进行测定;乳酸含量使用南京建成生物工程研究所A019-2乳酸试剂盒测定。
  1.6 数据处理
  用SPSS 19.0软件对数据进行单因素方差分析,并用Duncan氏法进行多重比较,并应用多项指标综合指数(MFAEI)进行评定,P≤0.05表示差异显著。

  式中:A1是对照组各个时间点各指标数值;A2分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%及2.5%组各个时间点各指标数值;A3是在每个时间点A2总和的平均值。MFAEI为各SFAEI的加和值。
  2结果
  2.1 不同NFC/NDF底物中添加不同水平YC对瘤胃发酵液pH的影响由表3可知,在不同底物发酵条件下发酵液pH随着发酵时间的延长而降低。常规底物条件下,发酵3~12h时,各试验组发酵液pH均高于对照组,但差异不显著(P>0.05);发酵24h时,0.5%组、1.0%组和1.5%组发酵液pH均显著高于对照组(P<0.05),2.0%组与2.5%组发酵液pH与对照组相比差异不显著(P>0.05)。


  高NFC底物条件下,发酵3和6h时,各试验组发酵液pH均高于对照组,但差异不显著(P>0.05);发酵9h时,2.0%组与2.5%组发酵液pH显著高于对照组(P<0.05),其余各组发酵液pH虽有所升高,但差异不显著(P>0.05);发酵12h时,2.0%组与2.5%组发酵液pH显著高于对照组(P<0.05),1.0%组与1.5%组发酵液pH显著低于对照组(P<0.05),0.5%组发酵液pH与对照组相比无显著差异(P>0.05)。发酵24h时,0.5%组、1.0%组和1.5%组瘤胃发酵液pH显著高于对照组(P<0.05),2.0%组和2.5%组与对照组无显著差异(P>0.05)。

  2.2 不同NFC/NDF底物中添加不同水平YC对瘤胃发酵液NH3-N含量的影响由表3可知,在不同底物条件下随着发酵时间的延长,发酵液NH3-N含量均呈现升高的趋势。常规底物条件下,各组NH3-N含量在发酵12h时达到最高,在24h时有所降低。发酵3、6和12h时,各试验组NH3-N含量均高于对照组,但差异不显著(P>0.05);发酵9h时,1.0%组和1.5%组NH3-N含量显著高于对照组(P<0.05),其他各试验组NH3-N含量虽高于对照组,但差异不显著(P>0.05);发酵24h时,1.5%组NH3-N含量显著低于其他各组(P<0.05),其他各组间无显著差异(P>0.05)。
  高NFC底物条件下,发酵3h时,添加YC各组NH3-N含量均高于对照组,其中1.5%组、2.0%组和2.5%组与对照组相比差异显著(P<0.05),0.5%组和1.0%组与对照组相比无显著差异(P>0.05);发酵6h时,1.0%组的NH3-N含量最低,且显著低于对照组(P<0.05),其余试验组与对照组相比均无显著差异(P>0.05);发酵9h时,添加YC各组NH3-N含量均低于对照组,且差异显著(P<0.05),1.5%组NH3-N含量显著低于对照组(P<0.05);发酵12h时,1.5%组NH3-N含量显著低于对照组(P<0.05),其余各试验组与对照组相比无显著差异(P>0.05);发酵24h时,0.5%组和1.5%组NH3-N含量显著低于对照组(P<0.05),其他各组间无显著差异(P>0.05)。
  2.3 不同NFC/NDF底物中添加不同水平YC对瘤胃发酵液MCP含量的影响由表3可知,在不同底物条件下MCP含量随着发酵时间的延长呈现先升高再降低的趋势。常规底物条件下,发酵3、9和24h时,各试验组MCP含量均高于对照组,但差异不显著(P>0.05);发酵6h时,1.5%组MCP含量显著高于对照组(P<0.05),其他各试验组MCP含量与对照组相比差异不显著(P>0.05);发酵12h时,添加YC各组MCP含量均高于对照组,其中1.5%组和2.0%组差异显著(P<0.05),其他各试验组与对照组之间无显著差异(P>0.05)。
  高NFC底物条件下,发酵3h时,0.5%组、1.0%组和1.5%组MCP含量显著低于对照组(P<0.05),2.0%组和2.5%组与对照组相比无显著差异(P>0.05);发酵6h时,1.5%组和2.0%组MCP含量显著高于对照组(P<0.05),其余各试验组与对照组相比无显著差异(P>0.05);发酵9h时,1.5%组MCP含量显著高于对照组(P<0.05),1.0%组和2.5%组MCP含量显著低于对照组(P<0.05),0.5%组与2.0%组与对照组相比无显著差异(P>0.05);发酵12h时,添加YC的各组MCP含量显著高于对照组(P<0.05),其中以1.5%组最高;发酵24h时,各组间MCP含量无显著差异(P>0.05)。
  2.4 不同NFC/NDF底物中添加不同水平YC对瘤胃发酵液乳酸含量的影响由表3可知,在不同底物条件下各组乳酸含量均随着发酵时间的延长而逐渐升高。常规底物条件下,发酵3~9h时,各试验组乳酸含量均低于对照组,但差异不显著(P>0.05);发酵12h时,添加YC各组乳酸含量均显著低于对照组(P<0.05);发酵24h时,1.5%组和2.5%组乳酸含量与对照组相比差异不显著(P>0.05),1.0%组和2.0%组乳酸含量显著高于对照组(P<0.05),0.5%组乳酸含量显著低于对照组(P<0.05)。
  高NFC底物条件下,发酵3~9h时,各试验组乳酸含量与对照组相比无显著差异(P>0.05);发酵12和24h时,添加YC各组乳酸含量均显著低于对照组(P<0.05),其中发酵12h时以0.5%组乳酸含量最低,发酵24h时,以0.5%组和1.5%组乳酸含量最低。
  2.5 不同NFC/NDF底物中添加不同水平YC对瘤胃发酵液VFAs含量的影响

  由表4可知,发酵液总挥发性脂肪酸(TVFA)含量随着发酵时间的延长持续升高且发酵各阶段TVFA含量均高于对照组。常规底物条件下,发酵3h时,1.5%组和2.5%组丙酸百分比显著高于对照组(P<0.05),2.5%组丁酸百分比显著高于对照组(P<0.05),0.5%组、1.0%组、2.0%组TVFA含量均显著高于对照组(P<0.05),1.5%组和2.5%组与对照组相比无显著差异(P>0.05);发酵6h时,0.5%组和1.5%组丁酸百分比显著高于对照组(P<0.05),2.0%组TVFA含量显著高于对照组(P<0.05),其他各试验组与对照组相比无显著差异(P>0.05)。发酵9h时,2.0%组丙酸百分比显著高于对照组(P<0.05),2.5%组显著低于对照组(P<0.05),0.5%组、1.5%组、2.0%组和2.5%组丁酸百分比显著高于对照组(P<0.05),0.5%组和1.5%组TVFA含量显著高于对照组(P<0.05),但1.0%组、2.0%组和2.5%组虽有升高的趋势但差异不显著(P>0.05)。发酵12h时,2.0%组和2.5%组丙酸百分比显著高于对照组(P<0.05),0.5%组、1.0%组、1.5%组和2.0%组丁酸百分比显著高与对照组(P>0.05),1.0%组TVFA含量显著高于对照组(P<0.05),2.5%组与对照组相比无显著差异(P>0.05),0.5%组、1.5%组和2.0%组TVFA含量显著低于对照组(P<0.05)。发酵24h时,1.5%组和2.0%组丙酸百分比显著低于对照组(P<0.05);2.0%组的丁酸百分比显著高于其他各组(P<0.05);2.0%组和2.5%组TVFA含量显著高于对照组(P<0.05)。发酵3~24h,各组间乙酸百分比均无显著差异(P>0.05)。
  高NFC底物条件下,发酵3h时,2.0%组和2.5%组乙酸百分比显著高于对照组(P<0.05);0.5%组、1.5%组、2.0%组和2.5%组丙酸百分比显著低于对照组(P<0.05);2.0%组和2.5%组丁酸百分比显著高于对照组(P<0.05);1.5%组TVFA含量显著高于对照组(P<0.05),2.0%组和2.5%组TVFA含量显著低于对照组(P<0.05)。发酵6h时,2.0%组和2.5%组乙酸百分比显著高于对照组(P<0.05)。发酵9h时,2.0%组和2.5%组丁酸百分比显著高于对照组(P<0.05);1.0%组和1.5%组TVFA含量显著高于对照组(P<0.05)。发酵12h时,2.0%组和2.5%组乙酸百分比显著高于对照组(P<0.05);2.5%组丙酸百分比显著低于对照组(P<0.05);2.0%组丁酸百分比显著高于对照组(P<0.05);0.5%组、1.5%组和2.0%组TVFA含量显著低于对照组(P<0.05),2.5%组与对照组相比无显著差异(P>0.05),1.0%组TVFA含量显著高于对照组(P<0.05)。发酵24h时,各组间乙酸百分比无显著差异(P>0.05),2.0%组丙酸百分比显著高于对照组(P<0.05);0.5%组和1.0%组TVFA含量显著低于对照组(P<0.05),2.0%组和2.5%组显著高于对照组(P<0.05),1.5%组与对照组相比无显著差异(P>0.05)。
  2.6 不同YC添加水平对瘤胃发酵液参数的综合评定

  由表5知,不同底物条件下添加YC对个单项发酵指标的影响不同。常规底物条件下,pH以2.0%组和2.5%组较高;NH3-N含量以1.0%组和2.0%组较高;MCP含量以1.5%组和2.5%组较高;TVFA含量以1.5%组和2.5%组较高。高NFC底物条件下,pH以2.0%组和2.5%组较高;NH3-N含量以2.0%组和2.5%组较高;MCP含量以1.5%组和2.0%组较高;TVFA含量以2.0%组和2.5%组较高。从体外发酵单项指标无法确定YC适宜的添加水平,因此,需对各项指标进行综合评定。在进行不同YC添加水平瘤胃发酵指标的组合效应综合评定时,选定不添加YC组作为参照,依据MFAEI对pH及NH3-N、MCP和TVFA含量进行综合评定。常规底物条件下,MFAEI自高到底的排序为1.5%组>2.5%组>2.0%组>1.0%组>0.5%组,因此,常规底物条件下,以1.5%的YC添加水平对体外发酵作用效果最佳。高NFC底物条件下,MFAEI自高到底的排序为2.0%组>2.5%组>0.5%组>1.0%组>1.5%组,因此,高NFC底物条件下以2.0%的YC添加水平对体外发酵作用效果最佳。
  3讨论
  反刍动物短时间采食过量易发酵碳水化合物,其在瘤胃微生物作用下转化为大量有机酸(VFA和乳酸),导致瘤胃pH下降,进而引起SARA。有研究将瘤胃液pH5.8作为SARA的诊断依据。瘤胃液pH的变化主要是受瘤胃液中TVFA和乳酸含量的影响,由于乳酸电离度远高于一般的VFA,因此乳酸对瘤胃pH的影响更大。本试验结果表明,常规底物发酵过程中,发酵前12h发酵液pH均高于5.8,发酵24h时,对照组发酵液pH低于5.8,且添加YC能够显著提高瘤胃发酵液24h的pH,这与Lila等的研究结果不一致,可能是由于所选用YC的种类不同,且体外条件下发酵过程中所积累的VFA和乳酸不能及时的被瘤胃壁代谢吸收而导致24h的发酵液pH的降低。高NFC底物发酵过程中,对照组发酵9~24h时,发酵液pH低于5.8超过3h,这说明体外SARA模型建立成功。添加YC能够显著提高9~24h瘤胃发酵液pH,减少发酵液pH低于5.8的时间可以维持瘤胃pH的稳定,这与刘相玉等试验结果一致。底物中添加YC能显著提高TVFA含量,但同一时间点添加不同水平的YC对TVFA含量的影响并不一致,这可能是由于所添加活菌数不同而导致的,Dawson等研究表明,活菌含量的多少会影响YC的作用效果。乳酸作为瘤胃代谢的重要中间产物,其对瘤胃液pH的影响很大,有研究表明,瘤胃中乳酸的不断积累会导致乳酸产生菌和乳酸利用菌失衡,进而导致SARA的发生。乳酸含量的高低在一定程度上反映YC对SARA的调控作用效果是否显著,本试验结果表明,在高NFC底物条件下,添加YC能够显著降低9~24h时发酵液中乳酸含量,这与刘相玉等研究结果一致,这可能是由于YC中营养物质能够促进瘤胃中乳酸利用菌的利用,进而降低发酵液中乳酸含量。在高NFC底物条件下,添加YC能够显著提高TVFA含量,降低乳酸含量,稳定瘤胃液pH,具有缓解SARA的效果。
  反刍动物主要以VFA的形势利用碳水化合物,其中乙酸、丙酸和丁酸占瘤胃内TVFA总量的95%左右。乙酸是乳脂合成的主要前体,丙酸则是通过糖异生作用合成机体所需的葡萄糖,因此丙酸发酵型可为机体提供更多的能量,有利于提高动物的生产性能和饲料利用率。本试验中,常规底物条件下,添加YC对乙酸及丙酸比例无显著影响,但显著提高了丁酸比例和TVFA含量;而高NFC底物条件下,添加YC能够降低乙酸比例,提高丙酸和丁酸比例,提高TVFA含量。这可能是因为在不同NFC/NDF底物中,YC对其的作用效果不同,这与丁耿芝研究结果一致,随着饲粮粗精比的升高,丙酸比例提高而乙酸比例降低。这也说明在高NFC底物条件下,添加YC能够促进瘤胃发酵类型向丙酸发酵型发展。
  NH3-N含量在一定程度上反映了瘤胃微生物对底物含氮物质的利用程度,MCP主要是反映瘤胃微生物对发酵液中氮源的利用情况,其为动物机体提供蛋白质需要量的70%~80%。在体外试验中YC对NH3-N含量的影响作用存在争议,但有研究表明,添加YC能提高瘤胃液中MCP含量。高NFC底物条件下,添加YC能显著提高发酵3h瘤胃液的NH3-N含量,显著降低发酵6~24h瘤胃液的NH3-N含量,这可能是由于本试验所选底物为半纯合底物,其在体外发酵刚开始时被瘤胃微生物快速利用而导致瘤胃发酵液在发酵3h时NH3-N含量升高,在发酵进行的6~24h中YC能够促进瘤胃微生物对NH3-N的利用,进而导致发酵液中NH3-N含量降低,这与刘相玉等的研究结果一致。有研究表明,高NFC底物条件下,添加YC能够促进NH3-N的吸收和转化,进而降低瘤胃发酵液中NH3-N含量,提高MCP的含量。本试验中,高NFC底物条件下,添加YC能够显著降低发酵3h瘤胃液中MCP含量,显著提高发酵6~12h瘤胃液的MCP含量,这与NH3-N含量的变化趋势一致,这说明在高NFC底物条件下,添加YC能够促进瘤胃微生物的生长。
  因此,在高NFC底物条件下模拟SARA,添加YC能够通过降低发酵液中乳酸含量达到调控瘤胃发酵液pH的效果,促进瘤胃微生物对氨氮的利用于瘤胃微生物的生长,具有缓解SARA的潜力。但大量研究表明,YC在体内外对瘤胃发酵指标的影响作用具有一定差异,且YC的作用效果受多种因素(酵母菌种类、活性、添加剂量、饲粮种类)的影响。因此,未来需通过体内试验进一步来验证YC对SARA的缓解作用,还需应用现代科技手段筛选出更高效持久的缓解SARA的酵母产品。
  4结论
  ①当NFC/NDF为2.30时,可成功建立体外SARA模型。
  ②在高NFC底物条件下,添加YC能够稳定瘤胃液pH,提高TVFA含量,降低乳酸含量,具有缓解SARA的潜力,其中以添加底物干重的2.0%的YC对SARA的缓解作用最佳。
  ③添加YC对常规底物的作用效果不明显,以添加底物干重的1.5%的YC的改善作用效果最佳。

  来源:动物营养学报
  作者:任胜男,金亚倩,赵芳芳,王洪荣

 

文章来源:生物饲料工程研究中心     文章编辑:一米优讯     
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