|
摘要：筛选复配适合宁夏地区的青贮微生物菌剂，可解决在青贮自然发酵过程中，青贮玉米营养损失多且易发霉等问题。本研究对从宁夏中部干旱区自然发酵的青贮玉米饲料中分离鉴定的1株乳酸菌(Lactobacillus acidophilus)和1株酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)进行性能测定，复配后形成复合菌剂并进行45d的大型窖贮青贮发酵试验，设置不添加菌剂和添加商业菌剂的青贮饲料为对照组。营养成分测定结果显示，与不加菌剂和添加商业菌剂的对照组相比，经复合菌剂处理后饲料中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维显著下降(P<0.05)，干物质和粗脂肪含量显著增加(P<0.05)，粗蛋白含量变化不显著。为期75d的滩羊肥育饲喂和5 d的消化代谢试验表明，对照组与试验组滩羊的日均采食量差异显著俨(P<0.05)，平均日增重、末重、料重比差异不显著。试验组滩羊对青贮玉米饲料中粗蛋白、粗脂肪表观消化率显著提高(P<0.05)，中性洗涤纤维表观消化率提高，对酸性洗涤纤维的表观消化率影响不显著。结果表明，复合菌剂显著改善了青贮玉米料的品质，复合菌剂发酵的饲料玉米对滩羊生长有良好的促进作用。
玉米(Zea mays)是三大粮食作物之一，也是主要的饲料作物。用饲料玉米进行青贮已成为反刍动物饲料的主要加工方式。青贮饲料的制作表面简单，实则是一个极为复杂的微生物厌氧发酵过程。青贮饲料中的微生物主要有乳酸菌(Lactobacillus acidophilus)、酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)及其他腐败细菌等。借助乳酸菌可以将青贮原料中的可溶性碳水化合物转化为乳酸、乙酸等有机酸，降低pH，抑制有害微生物繁殖，最大限度地保持青贮原料的营养成分，并延长饲料的保存周期。
宁夏处于我国农牧过渡区，尤其中部干旱地区是农牧交错区，以滩羊为代表的畜牧业是其主要的农业经济产业。但饲喂滩羊的青贮玉米依然多采用自然发酵方式。研究表明，青贮原料上天然附着的乳酸菌数量较少，在青贮过程中产酸不足，不能迅速降低青贮体系的pH，抑制青贮饲料中其他微生物的繁殖能力较弱。青贮饲料中微生物大量繁殖，导致青贮饲料蛋白含量下降，降低青贮饲料的营养价值。青贮饲料制作过程中常出现发霉变质现象，不仅造成营养物质的严重损失和饲料原料浪费，更严重的是霉变的青贮饲料会对动物健康造成严重危害，处理不当还会对当地环境造成严重污染。研究表明，通过人工添加乳酸菌增加青贮体系中乳酸菌数量，迅速产生大量的乳酸，加快发酵过程，可弥补自然发酵青贮饲料的不足，提高青贮饲料的发酵品质。然而，目前市面上针对宁夏地区专用的青贮玉米菌剂种类较少，且现有商业青贮菌剂成分主要为单一产酸的乳酸菌菌株，其中的乳酸菌不能适应宁夏地区特殊的气候环境导致乳酸菌活性较低，从而导致商业青贮菌剂的青贮效果不佳。
本研究对从宁夏回族自治区自然发酵的青贮玉米饲料中通过有益菌群筛选、分离出的乳酸菌和酵母菌菌株进行性能评估，复配形成适用于宁夏地区的复合青贮菌剂并接种于玉米饲料青贮，通过微生物的代谢活动提高青贮玉米饲料的营养价值和保存质量，并通过滩羊饲喂和消化代谢试验，探究青贮玉米饲料的饲喂效果。这将对宁夏地区推广使用优化的青贮菌剂和滩羊养殖业的发展具有积极意义。
1 材料与方法
1.1 分离菌株的性能测定与复配
已分离鉴定的1株乳酸菌和1株酵母菌，来自本实验室从宁夏中部干旱区多个地点采集的玉米饲料自然发酵样品，通过有益菌群培养、筛选获得，本研究进行菌株的性能测定。
乳酸菌产酸速率测定：取分离的乳酸菌于MRS培养液中振荡培养24h进行活化，之后以3％的接种量接入MRS液体培养基，37℃恒温振荡培养。从接种0h开始，每隔2h测定乳酸菌发酵液pH，连续测定30h。
菌株生长性能测定：结合其产酸速率测定实验进行。从接种培养0h开始，每隔2h取样，以MRS培养基为空白对照，600am波长下测定样品吸光值，连续测定30h。酵母菌首先在YPD液体培养基活化培养24h，之后以3％的接种量接入YPD液体培养基，28℃恒温振荡培养。从接种0h开始，每隔2h取一次样，以YPD液体培养基为空白对照，660nm波长下测定样品吸光值，连续测定30h。
复合菌剂复配：分别取上述乳酸菌和酵母菌菌株，活化并培养后以1：1复配提供菌种，委托慕恩(北京)生物科技有限公司进行生产性发酵。复合菌剂活菌总数≥1×1010CFU·g-1。青贮试验用的对比菌剂购自山东鼎创生物科技有限公司的商业青贮菌剂，说明书显示其活菌总数≥1×1010CFU·g-1。
1.2 饲料玉米青贮试验
青贮用玉米原料产自宁夏回族自治区盐池县生长到蜡熟期的全株青贮用玉米。随机取样后测定其营养成分。青贮试验共分4组，青贮菌剂的添加量依据菌剂中活菌数确定。处理A为对照：不添加任何菌剂和添加剂，进行自然发酵；处理B：添加2g·t-1商业菌剂发酵，活菌总数≥1×1010CFU·g-1；处理C：添加3g·t-1商业菌剂发酵，活菌总数≥1.5x1010CFU·g-1；处理D：添加2.5g·t-1复合菌剂发酵，活菌总数≥1×1010CFU·g-1。每个处理3个重复，新鲜全株玉米收割后粉碎成5cm左右的秸秆，菌剂与蒸馏水混匀，喷雾器喷洒至原料，放入青贮窖压实，塑料薄膜包覆，密封发酵45d。青贮窖的青贮容量在80t以上。
1.3 青贮后玉米饲料营养成分测定
发酵45d后开窖，采用三点取样法，取每个重复距表层40 cm的青贮玉米饲料混合。每个重复的取样量为1kg，装入无菌自封袋，低温快速送至宁夏大学饲料工程技术研究中心进行营养成分测定。测定指标包括粗蛋白、粗脂肪、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、粗灰分和总氮。
1.4 滩羊饲喂试验
从盐池县种羊场选购体重20kg左右的当年3月龄断奶滩羊羔羊14只，随机分为两组，每组7只。对照饲喂不添加菌剂的处理A自然发酵青贮玉米饲料，试验组饲喂添加复合菌剂的处理D青贮玉米饲料。在鲜重基础上日粮组成为：青贮玉米饲料(50％)+羊草(20％)+精料补充料(30％)，日粮组成及营养水平见表1。
试验期共持续75d，其中预饲期15d，用于羊只适应环境并确定饲喂量。所有试验羊单栏饲养，饲喂试验期间所有羊只自由采食、饮水。饲喂试验开始后，每天称量每只滩羊的饲喂量和剩余量，计算当日采食量；每隔20d进行称重一次。试验结束前，试验滩羊转移至消化代谢笼，进行为期5d的消化代谢试验，收集羊只的全部鲜粪称重，测定粗蛋白、粗脂肪、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量。
1.5 数据处理
数据经Excel初步整理后，采用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析和T检验进行差异显著性分析，P<0.05为差异显著判定值。
2 结果与分析
2.1 菌株性能测定
乳酸菌产酸性能和乳酸菌、酵母菌生长性能的测定结果见图1。从图1a可知，分离的乳酸菌产酸性能良好，从培养开始至12h内可产生大量乳酸并在24h内使培养液的pH从6.5迅速下降至4.0。从图1b可知，乳酸菌培养8h可达到生长峰值，酵母菌培养24～26h时达峰值。
2.2 发酵前后青贮饲料玉米的营养成分
由表2可知，D组青贮饲料玉米的干物质含量显著高于A、B、C3组，B、C组在添加商业菌剂后干物质含量较A组提高，但显著低于D组。与对照A相比，添加商业菌剂的B、C组粗蛋白含量均显著下降(P<0.05)，B、C组之间差异不显著；添加复合菌剂的D组虽略有下降，但与对照组差异不显著；但D组的粗蛋白含量显著高于B、C组(P<0.05)。说明复合菌剂抑制青贮饲料中蛋白质分解的作用优于商业菌剂组。
与对照A比较，添加复合菌剂发酵后最显著的变化是酸性和中性洗涤纤维含量的降低。复合菌剂D组无论是酸性洗涤纤维还是中性洗涤纤维均显著低于A、B、C组(P<0.05)，说明复合菌剂降解青贮玉米饲料中纤维素、半纤维素的能力远大于商业菌剂。相反，D组的粗脂肪含量显著高于A、B、C组(P<0.05)，表明经复合菌剂发酵后能够提高青贮玉米饲料的脂溶性物质含量；商业菌剂的粗脂肪含量则随活菌数增加有进一步降低的可能。表中数据也表明，玉米饲料经菌剂发酵后粗灰分和总氮含量均有降低，但复合菌剂D组的降低程度均低于商业菌剂B、C组，并且粗灰分与B、C组差异达显著水平(P<0.05)。
综合分析青贮后玉米饲料的营养指标结果，尽管复合菌剂D组的粗蛋白含量较A组略有下降，但在其他指标上，尤其在提高粗脂肪、降锯酸性和中性洗涤纤维含量方面均显著优于A、B、C组。
2.3 复合菌剂青贮玉米饲料对滩羊生长性能的饲喂效果与对照组相比，处理组滩羊的日均采食量显著增加(P<0.01)。饲喂结束时的末体重、平均日增重和料重比虽然未达到显著差异水平，但处理组末体重和平均日增重明显较对照组提高，料重比下降。说明复合菌剂改善了青贮玉米饲料的适口性，提高了滩羊的日均采食量，对饲料的利用率增加，进而提高了滩羊的平均日增重，最终提高了饲料转换效率(表3)。
2.4 复合茵剂青贮玉米饲料对滩羊的表观消化率与对照组相比，处理组滩羊极显著地提高了对饲料中粗蛋白的表观消化率(P<0.01)，对粗脂肪的表观消化率也显著提高(P<0.05)；对中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的表观消化率有提高趋势，尤其是中性洗涤纤维接近了差异显著水平(P=0.053)(表4)。
3 讨论
乳酸菌的初始产酸量和菌群的生长速度往往决定玉米青贮的质量和成败。良好的菌株必须达到以下基本条件：快速增殖，能与其他微生物区系竞争而且成为优势菌种；能快速产生乳酸并尽快降低pH最终达到4.0;菌株本身耐酸等。本试验结果显示，我们分离出的乳酸菌菌株具有上述特性。目前市面上普遍使用的商业化菌剂中一般是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，两者均属于具有较强产酸能力的同型发酵乳酸菌，其进入指数生长末期的时间均是12～13h。本研究分离的乳酸菌能在8h达到指数生长的高峰，比一般菌剂提前4～5h，且能在12h内产生大量的乳酸并在24h内速降低培养液的pH到4.0，说明该菌株是在长期进化和适应当地气候环境中形成的优势菌株，具有迅速产生青贮发酵酸环境的良好功效。
粗蛋白含量是感官测定外衡量青贮饲料品质的一个重要指标。席兴军在青贮玉米饲料中添加乳酸菌后也观测到粗蛋白含量从7.22％下降至6.74％，与本研究结果的趋势一致。主要原因是由于在青贮发酵初期，青贮原料中存在多种厌氧、耐酸的梭菌，可以把青贮原料中的蛋白质分解成氨气和胺；同时，由于青贮原料刈割后植物呼吸作用和植物蛋白酶的作用，使青贮原料中的蛋白质被分解为肽、游离氨基酸等，导致青贮饲料粗蛋白含量下降。本研究结果显示，分离得到的乳酸菌能够在接种后8 h迅速大量繁殖，在发酵初期就能有效降低植物呼吸作用和酶的活性，抑制有害附生微生物繁殖，减少了青贮早期的植物呼吸作用对糖的氧化和对蛋白质的水解，从而抑制蛋白质降解成非蛋白氮，较好地保持了青贮原料的营养价值，因而相较于商业菌剂的发酵青贮，复合菌剂发酵的玉米青贮粗蛋白含量下降较少。同时，复合菌剂中的酵母菌可以增加青贮饲料中微生物蛋白质的含量，同时生成醇类等物质，使青贮饲料具有特殊的香味，能够提高青贮饲料的营养价值和适口性，进而导致饲喂试验中日均采食量显著增加。
中性洗涤纤维代表青贮饲料中的结构性碳水化合物，与青贮饲料的适口性相关，青贮饲料的中性洗涤纤维含量越低，家畜的采食量越高；酸性洗涤纤维影响反刍动物对青贮饲料的消化能力，青贮饲料中酸性洗涤纤维含量越低，青贮饲料的消化率越高。本研究显示，添加复合菌剂后青贮玉米饲料的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量均有较大程度下降，说明乳酸菌和酵母菌在青贮发酵过程中产生的纤维素酶和脂酶等酶类起到了降解纤维素的作用，这与任付平的研究结果一致。
相关研究表明，青贮饲料中的粗脂肪含量相对较少，粗脂肪作为一种高能量物质在动物营养中发挥着重要作用。使用复合菌剂青贮后，青贮的粗脂肪含量显著上升，高于对照组和商业菌剂组，说明在复合菌剂及其分泌的酶类作用下产生了一些脂溶性营养物质，致使青贮饲料具有更高的营养价值，这与李旭业等的研究结果一致。
饲喂和消化代谢试验结果显示，在日粮代谢能和粗蛋白水平近似的情况下，饲喂添加复合菌剂的青贮玉米饲料，滩羊日均采食量、平均日增重和末体重均高于对照组，这也与Nkosi等、Basso等、Ando等报道的研究结果一致或相似，表明饲喂菌剂青贮饲料对滩羊生长产生了促进作用。除日均采食量的提高，青贮饲料持续保持的低pH环境也有助于降低乙酸、丁酸以及其他有害微生物的数量，提高干物质回收率，提高了青贮饲料的利用率，从而提高动物的生产性能。同时，青贮玉米饲料中的乳酸菌、酵母菌等有益微生物作为益生菌进入反刍动物瘤胃后，在瘤胃中生长繁殖，可以抑制胃肠道病原微生物的生长，起到调节胃肠道菌群平衡的作用；也刺激消化道上皮组织，促进了营养物质的吸收。
日粮的营养水平是影响反刍动物消化代谢的直接因素。本研究证明，试验羊只对饲料粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和粗脂肪的表观消化率显著增加，其他研究者也得到菌剂青贮饲料可以提高粗蛋白以及中性洗涤纤维例消化率的结果。玉米经青贮复合菌剂青贮发酵后，饲料中的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维显著降低，致使相同配比日粮中菌剂青贮组的纤维含量明显低于对照组。低纤维日粮增加青贮饲料、羊草等在瘤胃内的滞留时间，降低饲料在胃肠道中的流通速度，从而提高了粗蛋白、粗脂肪以及钙、磷等矿物质在消化道中的表观消化率。青贮饲料中的乳酸能在滩羊瘤胃内被瘤胃微生物有效利用，促进了瘤胃微生物的繁殖，进而促进了瘤胃微生物将青贮饲料中的氮转化为微生物蛋白氮的生化反应，提高了粗蛋白的消化利用率。同时，酵母菌和乳酸菌在增殖中产生的大量消化酶类，进一步加快了中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维在瘤胃内的降解，提高了滩羊对青贮饲料营养成分的利用率。
4 结论
本研究结果表明，复合菌剂接种后8h可迅速大量繁殖、24h时pH达到并稳定在4.0，可以显著降解玉米饲料的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维，提高干物质和粗脂肪含量，延缓粗蛋白的分解。使用复合菌剂发酵的玉米青贮饲喂滩羊，可显著增加滩羊的日均采食量，提高粗蛋白、粗脂肪和中性洗涤纤维的表观消化率，进而提高滩羊生长性能。
来源：中国生态农业学报
作者：王小平 王小琪 李 标 王 琳 段子渊
|
