猪轮状病毒(RV)引起的猪病和其他肠道疾病也有类似的临床症状,导致生长迟缓、嗜睡和腹泻。
针对RV的检测诊断方法不断发展,有多种可用的检测方法,下面也会对其优缺点进行介绍。
一、早期诊断工具
1.1 电子显微镜(EM)观察法
在EM下,病毒呈轮状颗粒,直径为65-75毫米(Chang等人,2012年),常见的是完整的三层传染性颗粒和边缘粗糙的双层颗粒(Chang等人,2012)。该方法的主要缺点是缺乏特异性和敏感性。且无法区分不同类群的轮状病毒,且机器昂贵,操作困难,临床应用较少,主要用于科学研究。
1.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
RV的dsRNA从粪便或肠道内容物样本中提取,装入聚丙烯酰胺凝胶中,并经受电流,其中RNA在凝胶中迁移,较小的RNA片段比较大的RNA片段移动得更快,凝胶用银染色。RNA片段产生电泳迁移模式。按迁移特征进行分类(图1)。PAGE方法最初可用于区分RVA血清群与由RVB和RVC组成的非典型RV菌株(Janke et al.,1990)。PAGE的一个缺点是该试验无法区分不同的RV,另外一个缺点是非常耗时。临床诊断中使用较少,但在科学研究中还有使用。
图1 不同血清型猪轮状病毒的PAGE迁移特征
二、当前主要使用的诊断方法
2.1 病毒分离
感染性RV诊断的金标准是细胞培养分离。但是因为RV难以分离,同时非常耗时和劳动密集型,它不常用于RV的诊断,但是在相关的疫苗研究中作用极大。
大多数RVA菌株在MA104细胞(非洲绿猴肾细胞系)中很容易分离和连续传代,并添加蛋白水解酶,如胰酶或胰蛋白酶。其他轮状病毒中的RVB、RVC、RVE和RVH等有分离的报道,但整体来说难以分离。
2.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)
常用于筛查疑似轮状病毒粪便的方法是酶联免疫吸附试验(ELISA)。以下两种试剂盒主要用于研究,而不是诊断。包括猪轮状病毒抗原ELISA试剂盒(比色法)(Novus Biologics,目录号NBP2-60133-1)和猪轮状病毒群特异性抗原ELISA试剂盒(Sandwich)(LifeSpan Biosciences,目录号LS-F10367-1)。可依据该试剂盒的说明书进行操作。
ELISA可用于多粪便样品RV快速可靠的检测,但是市售的主要针对RVA,其他猪的RV尚没有相应的试剂盒。
2.3 免疫组织化学(IHC)
小肠RVA抗原的鉴定通常采用免疫组织化学(IHC)方法。该方法中,一块组织被固定在10%福尔马林中,之后切片并放在载玻片上,并将抗RVA VP6多克隆抗体添加到载玻片中并孵育。然后加入与链霉亲和素-过氧化物酶相连的二级生物素化抗体。然后将载玻片与基质一起孵育,并使用Mayer苏木精进行复染(Almeida等人,2018)。图2为感染RVA(图2A)和RVC(图2B)后仔猪肠道的IHC。该方法的缺点是,尚无商业化针对RVE和RVH的单克隆抗体。限制了临床上对RV的研究。
图2 感染RVA(A)和RVC(B)后仔猪肠道的IHC
2.4 分子诊断分析
目前,在美国兽医诊断实验室中,RT-PCR或RT-qPCR被广泛的用来检测和区分RVA、RVB和RVC。
我的导师Marthaler等人(2014a)开发并介绍了用于RVA和RVC的多重实时(RT-qPCR)方法。该方法的特点是快速、准确、灵敏。然而,缺点之一是它只能检测核酸,同时如果病原发生变化,考虑到RV的多样性,该方法可能失效。
2.5 原位杂交RNA显色技术(ISH-RNA)
Resende等人(2019)介绍了原位杂交RNA显色技术(ISH-RNA),用于福尔马林固定的石蜡包埋组织。在这种方法中,研究人员使用针对RVA、RVB和RVC的VP6基因设计的探针来区分肠组织中的三种RV类型。这种研究技术最初是为了研究每种动物的RT-qPCR阳性结果与小肠组织学病变之间的关系。图3A中为RVA(绿色)和RVC(红色)混合感染的小肠组织,图3B为RVC(红色)感染的小肠组织,图3C为RVA(绿色)感染的小肠组织。ISH-RNA检测的优点之一是探针靶向mRNA,只能在活跃复制的病毒中检测到。这项新技术可以更好地帮助研究人员了解RVB和RVC的发病机制。ISH-RNA检测的缺点在Resende等人(2019年)的研究中,一些RT-qPCR阳性样本未通过该方法检测到。另一个可能发生这种情况的原因是ISH没有RT-qPCR那么敏感和特异。
图3 临床小肠组织不同感染情况下的ISH-RNA
2.6 下一代测序
下一代测序可以更好地了解不同的RV毒株。这是一种相对较新的方法,通过全基因组分析,研究人员可以将历史RV毒株基因组序列与当前RV毒株基因组序列进行比较(Chepngeno et al.,2020)。该方法的两个主要缺点是成本高和耗时。
三、总结
自1975年以来,猪RV感染的诊断试验有了很大的发展。更快,更准确,更具体的诊断测试已经能帮助我们更好地了解RV的感染情况。新的分子检测方法增加了研究人员对RV物种的了解,比如RVB和RVC,它们在细胞培养中很难分离。不同RV的诊断技术优缺点各不相同,可适用于不同的场景,同时某些场景下可使用不同的检测方法进行比较验证。对于RV的检测诊断,特别是对新RV毒株的挖掘,对RV疫苗的研发十分重要。
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