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应对非洲猪瘟,猪场日常管理生物安全细节(五)


现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2021/5/13 19:30:27 关注:549 评论: 我要投稿

新希望六和——生物环保饲料
  在非洲猪瘟的防控过程中,准确、快速、及时地诊断对尽早发现疫情,及时处理极其重要。为确保能够从实验室检测中获得准确的诊断结果,在临床取样时应重点考虑动物发病的时间、治疗史、发病状态来选择最佳时机和最具代表性的动物进行采样。其次,有效的样本采集后,如何使用正确的运输方式提交到实验室进行检测也会影响诊断结果的准确性。临床兽医对诊断结果最大的贡献就是以最可靠的采集和运输方式向诊断实验室提供最合适的临床样本。同时,实验室选择正确有效的检测方法对送检样品进行规范准确的检测是非洲猪瘟疫情确诊和阳性动物筛查的重中之重。
  01
  样品的采集、运送与储存
  我国要求对非洲猪瘟的诊断、报告与防控必须严格遵照《中华人民共和国动物防疫法》《突发重大动物疫情应急预案》《非洲猪瘟防治技术规范》《非洲猪瘟防控应急预案》的要求执行。疑似样品的采集、运送与保存必须符合《病原微生物实验室生物安全管理条例》的规定,样品的采集,运送和存储单位必须具备相应资格。
  样品的采集、运送与存储关乎诊断结果的可靠性、准确性。实验室检验能否得出准确结果,与病料取材是否得当、保存是否得法和送检是否及时等有密切关系。当有关单位或者个人怀疑发生非洲猪瘟疫情时,应及时向当地动物疫病预防控制机构报告。
  病猪和病死猪的全血、组织、分泌物和排泄物中均可能含有病毒。内脏器官弥漫性出血症状明显,故在采集组织病料时需首先通过剖检观察器官组织的病理变化,结合生前各项临床症状进行初步诊断,采集的脏器应尽可能全面,如疫点周边有野猪分布,应联合林业部门同时采集野猪样品。
  02
  样品的采集
  1. 全血和血清
  采样前提前准备好采血所需器材,如注射器、真空采血针和管、1.5mL 离心管、记号笔、样品袋、泡沫箱、冰袋、白纸和笔。抗凝血采集,从耳静脉或前腔静脉采集血液。
  用注射器吸取 EDTA 抗凝剂(不可用肝素抗凝,易抑制后续 PCR 反应),静脉采集血液5mL,颠倒混匀后,注入无菌容器。如条件允许,最好每份血液样品采集 2 管,以便留存充足的备份样品。也可以用已经含有抗凝剂的真空采血器抽取血液。血清分离,对非洲猪瘟进行血清学样品采集时,需对病猪,健康猪以及处于不同发病阶段的猪分别采集血清。注射器(或真空采血针和管)采集全血 3~5mL,室温放置 12~24h,收集自然析出血清或离心分离血清,置于无菌容器中,封口,标识后放入加入冰袋的泡沫箱送检。
  2. 口腔 / 鼻 / 血液拭子
  采样前提前准备好无菌棉签、离心管、生理盐水、手套、记号笔。离心管内加生理盐水或者 PBS 适量,以没过棉签头为宜。
  口腔拭子采集,将无菌棉拭子插入猪口腔中,5~10cm 深,转动棉拭子顺时针和逆时针擦拭口腔数次,拿出棉拭子放到加有 2~3mL 生理盐水的离心管中,挤压几次,并折断木棒,盖上离心管管盖。
  鼻拭子采集,将无菌棉拭子斜 45°角插入猪鼻腔中线附近,5~10cm 深,把鼻拭子贴着猪鼻腔周壁顺时针擦两到三圈,然后逆时针擦拭,然后换一个鼻孔重复这套动作,保证拭子看起来湿润。
  拿出棉拭子放到加有 2~3mL 生理盐水的试管中,挤压几次,并折断木棒,盖上离心管管盖。
  血拭子采集,用一次性注射器在猪只耳朵处扎一下,用无菌棉拭子反复擦拭流出来的血液,将棉拭子放到加有 2~3mL生理盐水的试管中,挤压几次,并折断木棒,盖上离心管管盖。
  应该注意,采样前,务必保证采样管、无菌棉拭子、自封袋等物品处于干净清洁、未被污染的状态。采集的每头猪的口腔液、鼻拭子、血液拭子,要分开装入采样管内;装有猪口腔液、鼻拭子、肛门拭子、全血的采样管,要分开装入自封袋内;自封袋密封严实后,标注相应信息,置于加冰袋的无菌容器内,标明动物编号。
  3. 口腔液样本
  根据猪群日龄不同,选不同直径全棉绳进行采集,保育猪可用直径 1.3cm 绳索,而生长育肥猪和生产公母猪口则选用直径 1.6cm 的绳索进行口腔腔液采集,悬挂处应远离饲槽和猪排便区。棉绳上端固定,下垂高度与猪只的肩关节齐平,任猪咀嚼,30min 后收取棉绳,刮取和挤压口腔液至自封袋,然后装入 EP 管或其他容器。一般认为≥ 1mL 为有效采集量。采集完毕应立即取走绳索,避免猪群失去对绳索兴趣,不利于下次采集。
  4. 粪便
  以清洁玻棒或棉棒挑取新鲜粪便少许(约 1g),置于无菌容器内,也可用棉拭子自直肠内直接蘸取或掏取。
  5. 脾脏、淋巴结、肝脏、肺脏等实质器官检测 ASFV 时,脾脏为首选器官,其次为淋巴结。肉眼所见有病理变化或没有病理变化的脾脏、淋巴结都应在采集样品范围之内。淋巴结可连同周围脂肪整个采取,其他器官可选病变明显部位与健康部位交界处,以无菌操作剪取直径 1cm 左右的组织样品,加入含 100μg/mL 青霉素和链霉素的 PBS 溶液中,4℃保存运输。或保存于含 50% 甘油的 PBS 溶液中,4℃保存运输。为保持病毒的感染性,样品到达实验室后,立即放入 -80℃低温冰箱内冷冻保存。若条件允许,可另取少许制触片数张,一并送检。
  注意事项:在舍外采集死猪脾脏、淋巴结时,必须着一次性防护服、一次性手套,每采集一头死猪的脾脏、淋巴结,更换一次手套、刀片。每头死猪的脾脏、淋巴结,要分开装入自封袋内,确认密封严实后,标注相应信息,放入泡沫箱加冰袋送检。采集死猪样品时,必须在远离猪舍的环保区进行,并且要注意采样时的生物安全,以及采样后的生物安全工作,及时对死猪进行无害化处理,对采样场地进行有效的消毒处置,以确保不污染环境。
  6. 水样
  可用矿泉水瓶作为水样采样工具。采样点一般为蓄水池、生产区各栋舍出水口、洗车用水等,使用新矿泉水瓶采集采样点水样,每次采样时务必做好生物安全防护和注意生物安全操作,防止将水池内水体进行二次污染和所采集的水样被污染。
  7. 环境样品
  提前准备纱布 / 棉拭子、采样管、自封袋、生理盐水、一次性手套。纱布裁剪成面积 2cm×5cm 或 10cm 长度的纱布,或者可以直接购买纱布块。
  采集方法,第一步戴好手套,用裁剪好的纱布 / 棉拭子,蘸取生理盐水;第二步擦拭采样点(面积越大越好);第三步放入采样管(或样品袋)内,在采样管或样品袋中加入生理盐水,浸没纱布;第四步做好标记。应用场景,猪舍内外环境样品,如猪舍内(地面、料槽、水槽、刮粪板、墙面、栏杆等),猪舍外(储粪池、水、地面、道路等),生活区和办公区(地面、桌面、电脑等)。车辆样品,采样部位包括车头、驾驶室、车轮(前)、车轮(后)、车体外表面(左)、车体外表面(右)、车顶、底盘、车厢内表面、车厢外表面、车厢内部升降(第一、二、三层等)。
  注意事项:采样前,务必保证采样管、纱布、自封袋等物品处于干净清洁、未被污染的状态。一个采样点换一个手套。每个采样点或或者一个单元的样品要单独放于一个自封袋内,标记好采样地点。附上送检单,冷藏保存或运输。
  8. 人员样品
  可用蘸取生理盐水的棉拭子,擦拭相关人员的头发、鼻腔、口腔、耳朵、脸部、手及指甲缝、衣服、鞋底、手机等部位或物品,拿出棉拭子放到加有 2~3mL 生理盐水的离心管中,挤压几次,并折断木棒,盖上离心管管盖。
  9. 软蜱
  在非洲和欧洲的很多国家,软蜱可以通过叮咬猪或野猪传播 ASFV,成为非洲猪瘟非常重要的生物虫媒,并可以作为ASFV 的自然宿主。一般来说,可以采用手工方式捉软蜱。通过手工移除裂缝和猪舍墙壁孔洞中的尘土,清理木质或瓦屋的屋顶缝隙,从猪舍道路上或路边挖掘均可进行软蜱的收集。也可以在野猪出没的地方查找软蜱的存在。但这种方法费时、费力,由于软蜱的寄居环境潮湿,黑暗,发现难度大,且难以找到更小的幼虫阶段的虫体。因此,手工方法不适合进行大规模软蜱的采集。
  在非洲、欧洲的一些国家,二氧化碳诱捕法、真空抽吸法广泛应用于田间软蜱样品的采集。
  10. 病理组织学检测样品
  若需采集病料进行病理组织学检测,应选取剖检有典型病变的部位,连同邻近的健康组织一并采取。如果某种组织器官具有不同病变时应各采一块,将标本切成 1~2cm3 大小,用清水冲去血污,立即浸入固定液中。
  常用的固定液为 10% 福尔马林,固定液的用量应为标本体积的 10 倍以上。脑、脊髓组织最好用 10% 中性福尔马林溶液(即在 10% 福尔马林溶液中加 5%~10% 碳酸镁)固定。初次固定时,应于 24h 后更换新鲜溶液一次。一头病死猪的标本可装在一个瓶内,如同时采集几头病猪的标本,可分别用纱布包好,每包附一纸片,纸片上用记号笔标明病猪的号码。
  11. 样品选取和采集过程中的注意事项
  (1)合理取材。不同疫病要求采取的病料不同。怀疑非洲猪瘟时,应按照《非洲猪瘟防治技术规范》的要求采集病料,确保送检样品合格、规范,方便后续的实验室检测工作。如果怀疑除非洲猪瘟外还有多种疫病同时感染,应综合考虑,全面取材,或根据临床和病理变化有侧重地取材。
  (2)剖检取材之前,应先对病情,病史加以了解,并详细进行临床检查。取材时,应选择临床症状明显,病变变化典型,有代表性的病猪。最好能选送未经抗菌药物治疗的病例和发病猪生前活体样品送检。
  (3)病死猪要及时取材,夏季不超过 4h,若死亡时间过长,则组织变性、腐败,影响检测结果。
  (4)除病理组织学检验病料及胃肠内容物外,其他病料应无菌采取,器械及盛病料的容器须事先灭菌。
  ①刀、剪子、镊子、针头等金属制品需高压灭菌,尽可能采用一次性无菌注射器;②试管、平皿、棉拭子等可高压灭菌或干热灭菌;③载玻片事先洗擦干净并灭菌。
  (5)为了减少污染机会,一般应先采取微生物学检验材料,再取病理组织学检验材料。
  (6)牢记生物安全原则。
  ①样品采集人员做好个人防护,防止感染人兽共患病;②防止污染环境,避免人为散播疫病;③做好环境消毒和动物尸体的处理。
  03
  待检样品的保存
  待检的组织病料、血液、血清、体液、分泌物等待检样品必须保持新鲜,避免交叉污染和腐败变质。采样后如不能立即送检,应根据样品类别以及检测目的不同分类保存,以免影响检测结果的质量。一般情况下,所有拟送检样品均应低温,冷藏保存和运输。
  血清或抗凝全血送检前可放置于 4℃保存,之后冷藏运送至检测实验室。实验室收到样品后如果不能立即检测,应置于 -20℃保仔,或 -80℃长期保存。用于病毒分离或攻毒试验诊断的抗凝全血样品,应尽可能低温冷藏运送至检测实验室,到达实验室后立即存放于 -70℃以下,以确保病毒不丧失感染性。ASFV 抗体和提取的 DNA 在 4℃条件下保存数月不影响检测结果。但口腔液或口鼻拭子样品在4~6h内检测,其影响不大,若运输时间过长,应添加唾液保护剂或干冰运输以保护核酸不被核酸酶破坏降解。
  组织样品,如脾脏、淋巴结可于 50% 中性甘油溶液或含100μg/mL 青霉素和链霉素的 PBS 溶液中 4℃冷藏运送。到达实验室后立即存放于 -80℃以下。以上保存液均需充分灭菌后应用。
  盛装送检材料的容器须确实密封,固定,置于装有冷却用品的容器中迅速送检。夏天运输耗时较长时,需更换冷却剂一次或数次。
  活蜱样品在采集后应放于带螺纹塞、且有空气出入口的瓶或管中,样品瓶或管中放入潮湿的土或滤纸片。长期保存时,应放置于 20~25℃阴凉、潮湿环境下。为保持蜱体内 ASFV 的感染性,可以将带毒蜱存放于 -70℃以下。
  无水乙醇也可以用于带毒蜱的保存,但是此种样品仅能用于 PCR 检测病毒核酸。
文章来源:畜牧环境 ,作者 猪猪     文章编辑:一米优讯     
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