Abstract
黑水虻(Hermetia illucens)幼虫(BSFL)蛋白质含量丰富，具有应用于动物饲料的潜力。本试验旨在研究BSFL作为替代饲料添加剂对肉鸡沙门氏菌的免疫预防效果。结果表明，BSFL改善了小鸡的增重、CD4+ T淋巴细胞频率、血清溶菌酶活性和脾脏淋巴细胞增殖。此外，BSFL增强了肉鸡对鸡链球菌的细菌清除能力，提高了其生存能力。这些数据表明，BSFL具有预防作用，可刺激非特异性免疫反应，并可降低鸡链球菌的细菌负担。
黑水虻(BSF(Hermetia illucens, L.)是一种分布在世界各地的昆虫。BSF对于管理大量的动物粪便和其他有机废物很有用。是典型的环境净化昆虫。BSF生活在有有机废物的地方，如牲畜产品和垃圾。各种研究已经将BSF用于食品垃圾处理和畜产品垃圾绿色处理。同时，BSF的幼虫也被用作畜禽饲料。
BSF幼虫蛋白质含量丰富(40 ~ 44%)，氨基酸含量比豆粕高，是一种高价值的饲料。BSFL干物质(DM)含量高(35 ~ 45%)。它们富含赖氨酸(6 ~ 8%的粗蛋白质(CP))、钙(5 ~ 8%的DM)和磷(0.6 ~ 1.5%的DM)。BSFL也富含脂肪，根据其饲养基质的化学组成，脂肪在数量上(15 - 49%)和质量上的变化非常大。最近，关于不同类型昆虫粕作为猪和家禽饲料成分的适用性发表了有趣的结果。此外，当BSFL粉作为家禽日粮的饲料原料时，BSFL是肉仔鸡极好的能量和可消化氨基酸来源。另一份报告发现，作为完整日粮的组成部分，黑水虻粉可以提高鹌鹑的生长速度鸡伤寒沙门氏菌是一种严重的全身感染，可导致贫血、白细胞增多、肝脾肿大和肠道出血。虽然在澳大利亚、北美和欧洲大部分国家，家禽伤寒已被根除，但在我国家禽养殖业，仍是一个严重的问题。在此基础上，本研究旨在评价肉鸡饲粮中添加BSLF后的生产效率、免疫力和沙门氏菌感染情况。
本研究以健康肉鸡为研究对象，分别进行了生长性能、免疫检测和对沙门氏菌感染的生存能力监测等三项独立研究。所有的小鸡都被安置在独立的空气控制的房间里。他们可以免费获得自来水和特别的饮食。所有动物手术均由全南国立大学动物护理和使用委员会批准。在每个独立研究中，将雏鸡随机分为4组。对照组饲喂商业和营养完全不含抗生素的鸡饲料(韩汇生物)。、Gwangyang、韩国)。试验组饲喂相同饲料，分别添加1% (w/w) BSFL (1% BSFL饲喂组)、2% (w/w) BSFL (2% BSFL饲喂组)和3% (w/w) BSFL (3% BSFL饲喂组)。
选取80只1日龄罗斯肉鸡（未分公母），随机分为4个饲粮处理组(每组20只)进行生长性能试验。记录平均日增重(ADWG)、采食量(ADFI)和饲料系数(FCR)等生产性能性状。在整个试验期间，饲粮替代BSFL可增加ADWG(数据未显示)。在检查达到最终目标体重1.3 kg的时间长度后，对照组需要32天。而饲喂1、2和3% bsfl的组只需要30天。由此可见，饲喂BSFL可提高肉鸡的生长性能。
免疫试验:每组10只鸡饲喂特定饲粮，试验期20 d。动物实验步骤与上述相同。采用脾脏T淋巴细胞亚群测定、溶菌酶活性测定、脾脏细胞增殖试验等免疫检测方法。从每只鸡获得脾脏，将组织通过40?m尼龙网制备单细胞悬液(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, U.S.A.)。用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的小鼠抗鸡CD3 (BD Biosciences.)和藻红蛋白(PE)标记的小鼠抗鸡CD4 (Southern Biotech .)对分离的细胞进行染色，以确定T辅助细胞(CD3+CD4+)的组成比，如前面所述。为了检测T细胞毒性细胞，细胞用fitc标记的小鼠抗鸡CD3 (Southern Biotech)和pe标记的小鼠抗鸡CD8 (BD Biosciences)进行染色。使用FAC Sort流式细胞仪(BD Biosciences)分析淋巴细胞亚群。BSFL喂养组(1、2和3% BSFL喂养组分别为33.13、38.55和40.42%)脾脏中CD3+CD4+ T淋巴细胞百分比显著高于对照组(31.90%)，且呈剂量依赖性(对照组vs. 2% BSFL喂养组，P<0.05;。在本研究中，与对照组相比，bsfl喂养组的脾脏CD3+CD4+ T淋巴细胞百分比以剂量依赖的方式显著增加。这些结果表明，BSFL对肉鸡的免疫功能有一定的促进作用。
为了进行脾脏淋巴细胞增殖试验，脾细胞用PBS洗涤3次，然后再悬浮在2ml rmi -1640培养基(瑞士巴塞尔Lonza)中，其中添加了2% (v/v)的抗生素-抗真菌药物(Invitrogen公司，Valencia, CA, usa)。细胞悬液在RPMI-1640培养基中稀释至最终密度为1 × 107细胞/ml。将1毫升细胞悬液和100?g/ml刀豆蛋白a (ConA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, U.S.A.)加入24孔细胞培养板(Iwaki, Tokyo, Japan)的孔中。在5% CO2培养箱中41℃孵育24小时后，将3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5二苯基四唑盐(MTT) (Sigma-Aldrich)加入到细胞培养中，最终浓度为500?g/ml。细胞再孵育4小时。然后加入300?l的二甲基亚砜(DMSO)(Sigma-Aldrich)进行细胞培养。使用酶联免疫吸附试验(ELISA)平板阅读器(Thermo Labsystems，赫尔辛基，芬兰)在540nm波长读取每个样品的吸光度，获得光密度(OD540nm)，如前所述[14]。与对照组(OD540nm值为0.14)相比，BSFL饲喂组(OD540nm值为1、2和3% BSFL时分别为0.15、0.18和0.20)的脾脏淋巴细胞增殖呈剂量依赖关系显著增强(对照组vs. 2% BSFL饲喂组，P<0.05;对照组与3% BSFL组相比，P<0.01)。这些结果表明，摄入BSFL可增强肉仔鸡淋巴细胞的有丝分裂性。
在第20天从每只鸡的翼静脉采血，测定血清中溶菌酶活性。血清于4℃，2000 × g离心10 min。溶菌酶活性的测定采用以前描述过的方法。BSFL饲喂组(1、2和3% BSFL组分别为4.07、4.46和4.70)的血清溶菌酶浓度显著高于对照组(3.76)，且呈剂量依赖性(对照组vs. 2% BSFL饲喂组，P<0.05;(图3)一些吞噬细胞如巨噬细胞和多形核白细胞分泌溶菌酶。在抗原内化后，溶菌酶可以通过其吞噬活性，破坏细菌细胞壁中的糖苷键。在本试验中，饲喂2和3% bsfl组的血清溶菌酶活性显著高于对照组。血清中溶菌酶活性的增加与吞噬细胞的破坏活性增加有关。这些结果表明，持续摄取BSFL能够刺激吞噬细胞的活化。
为了研究BSFL对肉鸡的免疫调节作用，本试验测定了BSFL对韩国肉鸡行业中最严重的鸡沙门氏菌的预防作用。本研究使用的鸡沙门氏菌(SG3001)最初从自然发生的禽伤寒鸡中分离出来(国家兽医科学检疫总局)。所有雏鸡(每组20只)在试验感染细菌前，先适应特定的饲粮3周。在试验之前，通过泄殖腔拭子[10]获得的粪便样本进行细菌学培养，证实鸡无沙门氏菌。S. Gallinarum (SG3001)的制备方法为。每只鸡口服5 × 1010 cfu，这是我们之前研究确定的最佳剂量。然后在细菌攻毒后观察15天。他们的生存能力被记录下来。分别于感染后1、5、10和15 d采集泄道口拭子粪便样本。实验结束时，采集所有剩余雏鸡的肝脏、脾脏、盲肠和法氏囊。粪便样本和每个组织中的活菌计数按[2]进行测定。对照组首次观察死亡率为3 DPI。与对照组相比，bsfl喂养组的死亡率延迟了2-3天。1、2和3% bsfl喂养组的最终存活率分别为67、75和85%。然而，对照组的存活率只有50%(图4)。值得注意的是，与对照组相比，3% bsfl喂养组的存活率显著提高。由此可见，饲喂BSFL可提高试验感染鸡沙门氏菌肉鸡的成活率。这可能是由于BSFL具有普遍的免疫增强作用。
测定每只鸡16dpi时肝脏、脾脏、法氏囊和盲肠中活菌细胞计数。每个组织样本均用Precellys?24 (Bertin Technologies, Montigny-le-Bretonneux，法国)均质。匀浆用PBS连续稀释10倍，每稀释100?l涂于赖氨酸去氧胆酸木糖琼脂平板上，37℃孵育24小时。统计典型的黑色菌落，并表达为对数cfu/g组织，如前所述[14]。对代表性菌落进行革兰氏染色和生化鉴定[10]。每个样品都进行了重复测试。与对照组相比，bsfl喂养组在整个实验感染期间组织中的活菌细胞数量有减少的趋势。2和3% bsfl喂养组的组织中活菌细胞数与对照组差异显著(P<0.05)。
综上所述，BSFL饲喂可刺激肉鸡的非特异性免疫反应，提高肉鸡对鸡链球菌实验感染的存活率。以往的研究表明，使用免疫刺激剂可能会使动物的生长性能达到最大，因为动物更容易受到健康和免疫状态的影响，免疫系统应激或免疫系统脆弱，感染疾病负荷大，导致生长性能下降。因此，本研究中摄取BSFL引起的生长性能的提高可能与刺激的非特异性免疫状态有关。然而，本研究并未探讨BSFL对肉鸡鸡链球菌的确切保护机制。此外，由于BSFL含有一系列复杂的化合物，因此需要对BSFL的主要成分(s)负责其免疫增强作用的准确认识。这些研究目前正在进行中。
所有数据均表示为均数±均数标准差(SD)。数据的统计分析采用学生t检验。所有统计分析均使用SigmaPlot?10.0版本软件(Systat software, San Jose, CA, U.S.A.)进行。当P值小于0.05时
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