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摘要：在猪的生长发育过程中，肠道菌群的建立及其均衡结构的维持对猪的健康生长具有重要作用，了解仔猪不同生长阶段肠道菌群的结构和功能可为指导其不同阶段的营养调控和饲养管理提供理论基础。本实验采集巴马香猪 0 d（初生）、16d（哺乳期）和 40 d（保育期）3 个生长阶段的粪便样品，采用 16S rRNA基因高通量测序方法，分析巴马香猪不同生长阶段肠道菌群的纵向变化。Alpha 多样性指数表明，随着仔猪的生长发育，肠道菌群多样性显著增加，并在保育期多样性达到最高水平；在门水平，作为优势门的厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）在不同生长阶段呈逐渐升高的趋势，而变形菌门（Proteobacteria）呈下降趋势；在属水平，不同生长阶段的优势菌属不同，LEfSe 分析发现克雷伯菌属（Klebsiella）、肠杆菌属（Enterobacter）和球链菌属（Globicatella）等好氧菌和兼性厌氧菌为出生 0 d（初生）的特异性菌属，随着肠道中氧气的消耗，消化链球菌属（Peptostreptococcus）和消化球菌属（Peptococcus）等专性厌氧菌为 16 d（哺乳期）的特征性菌属，饮食的改变使得与消化纤维密切相关的瘤胃球菌属（Ruminococcus）和普氏菌属（Prevotella）成为出生 40 d（保育期）时的特异菌属；KEGG 功能预测分析发现，随着仔猪的生长发育巴马香猪肠道菌群功能呈动态变化。
猪是人类动物源性食品的重要来源，由于猪和人在生理学和免疫学等方面有相似之处，猪常作为研究人类健康的医学模型。Xiao 等对来自法国、丹麦和中国的 287 头猪的粪便进行宏基因组测序，发现在人类基因目录中的功能通路有 96%存在于猪肠道微生物组基因目录中，证实了猪作为人类生物医学模型具有独特的优势。巴马香猪原产于广西巴马瑶族自治县，其肉质优良、体型小和耐粗饲，是优良的地方猪种，具有悠久的饲养历史和稳定的遗传基因。
随着低成本和高通量测序技术的出现，对动物肠道菌群的研究急剧增加。然而，此类研究的局限性主要在于样品的收集。家禽生长周期较短，其相关研究没有较大的成本或时间限制。但商品猪饲养成本昂贵，从出生到上市的生长周期较长，并且难以处理，因此许多研究主要关注猪某一阶段肠道菌群的组成和多样性，猪在不同生长阶段肠道菌群的纵向变化鲜有研究。此外，不同猪种具有不同的肠道菌群特征，而目前的研究多以商品猪为研究对象，缺乏对优质地方猪种肠道菌群的研究。本研究采集巴马香猪 0 d（初生）、16 d（哺乳期）和 40 d（保育期）3 个生长阶段的粪便样品，采用 16S rRNA 基因高通量测序方法，探究巴马香猪仔猪不同生长阶段肠道菌群的纵向变化，为其营养调控和饲养管理提供参考。
1 材料与方法
1.1 动物饲养和样品收集
试验在广西巴马原种香猪农牧实业有限公司进行。选择 6 窝生产日期相近的巴马香猪母猪，母猪在产前和产后未接受过药物治疗或使用益生菌产品。仔猪出生后直至断奶与母猪饲养在同一栏中，28 d 断奶后转入保育舍分栏单窝饲养。所有仔猪从出生到研究结束均未接受抗生素治疗或使用益生菌产品。断奶后食用以玉米、豆粕、大豆和豆油为主要原料的保育猪商品饲料，主要营养成分为粗蛋白质 13.5%、粗灰分 7%、粗纤维7%、钙 1%、氯化钠 0.8%、赖氨酸 0.9%、水分 13.5%、总磷 0.35%和粗脂肪 1.5%。所有仔猪均自由采食和饮水。试验在巴马香猪出生 0 d（初生）、16 d（哺乳期）和 40 d（保育期）3 个时间点分别从每窝随机选择 3 头体重相近的猪采集新鲜粪便样品，采集后将同日龄和同窝仔猪的样品混合为一组，置于冻存管，然后转入-80℃冰箱保存备用。
1.2 DNA 提取、PCR 扩增和 16S rRNA 基因测序使用E.Z.N.A.?soil DNA kit（Omega Bio-tek, Norcross，GA，US）试剂盒进行粪便样品总 DNA 提取，并检测 DNA 浓度、纯度和完整性；使用引物序列：338F
（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′ ）
和806R
（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′），对微生物 DNA 中 16S rRNA 基因 V3-V4 可变区进行 PCR 扩增。将同一样本的 PCR 产物混合后使用 2%琼脂糖凝胶回收 PCR 产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）进行回收产物纯化，2%琼脂糖凝胶电泳检测，并用 Quantus? Fluorometer（Promega，USA）对回收产物进行检测定量。建库后利用 Illumina 公司的 Miseq PE300 平台进行测序。
1.3 生物信息分析
为了在随后的生物信息学分析中获得更准确和可靠的结果，使用 Fastp软件对原始测序序列进行质控，使用 FLASH 软件进行拼接；基于默认参数，使用 QIIME2流程中的 DADA2 插件对质控拼接之后的优化序列进行降噪处理。基于 Sliva 16S rRNA 数据库（v 138），使用 QIIME2 中的 Naive bayes（Vsearch 或 Blast）分类器对 ASVs 进行物种分类学分析。
2 结果
2.1 16S rRNA 测序质量评估采
用 mothur 软件基于 ASVs 水平进行稀释曲线分析，样本的 Shannon 稀释曲线（图1-A）和 Sobs 稀释曲线（图1-B）结果表明，当样品随机抽取的数据量为3000左右时，稀释曲线趋向平缓并最终达到平台期，说明测序深度足够，包含了样品中绝大多数的多样性信息，可用于后续分析。
2.2 ASV 菌群聚类分析
对巴马香猪 3 个生长阶段的粪便样品进行 16S rRNA 基因 V3-V4区域测序。经过质量控制后，从仔猪的粪便样本中总共检测到 559 890 个有效序列，共获得2 608 个 ASVs，其中核心 ASVs 有 73 个，巴马香猪在 3 个不同生长阶段检测到的 ASVs 个数分别为 483、375 和 1 348 个。基于 Sliva 16S rRNA 基因数据库对 ASVs 进行物种分类学分析，ASVs 被分为 27 个门、55 个纲、112 个目、193 个科、440个属和745个种。
2.3 猪肠道菌群多样性分析
本研究以细菌物种的多样性指数（Shannon）和丰富度指数（Chao）作为猪肠道菌群 Alpha 多样性的参数，用于探究巴马香猪肠道菌群结构在不同生长阶段的动态变化。Shannon 多样性指数表明，0、16 和 40 d 3 个生长阶段之间多样性存在极显著差异（图2-A）；Chao 多样性指数表明，0 d 与 16 d 肠道菌群丰富度相似，但均与 40d 存在极显著差异（图2-B）。总之，Alpha 多样性指数表明，随着仔猪生长发育，肠道菌群多样性显著增加，并在保育时多样性达到最高水平。
进行主坐标分析，分析不同生长阶段肠道菌群的差异。在门水平，哺乳期和保育期仔猪肠道菌群结构略有交叉，但是能够完全与初生仔猪的肠道菌群结构分开（图 3-A）；在属水平，仔猪在3个阶段的肠道生物能够完全分开（图3-B）。总之，随着猪日龄增加，肠道菌群的演替发生了明显变化。
2.4 物种组成分析
分类学分析结果表明，在门水平，共检测到27个门，其中共有的核心门为10个，出生0d、16d和40d3个时间点特有的门分为7、0和3个（图4-A）。仔猪肠道菌群的优势门为厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria）。厚壁菌门和拟杆菌门在不同生长阶段呈逐渐升高的趋势，厚壁菌门和拟杆菌门的丰度分别由初生期（BM0d）的21.73%和6.26%，逐渐增加到保育期（BM40d）的75.90%和16.03%；变形菌门（Proteobacteria）在初生（BM0d）时的丰度最高，占门细菌丰度的69.24%，后丰度逐渐下降，在16d和40d所占比例分别为12.75%和0.32%；梭杆菌门（Fusobacteria）仅存在于初生期和哺乳期，保育期完全消失（图4-B）。
在属水平共检测到440个属，其中优势菌属为81个，出生0、16和40d特有的菌属分别为130、32和68个（图5-A）。出生0d的优势菌属是埃希氏菌属-志贺氏菌属、和克雷伯菌属；16d的优势菌属是芽孢杆菌属、肠球菌属和拟杆菌属；40d的优势菌属是乳杆菌属和瘤胃球菌属。其中，肠球菌属仅存在于出生0d和16d，在40d时完全消失，而瘤胃球菌属在16d时才发现（1.44%），并在40d时丰度增加到5.47%（图5-B）。
2.5 微生物组成差异
采用 LEfSe 分析鉴定巴马香猪在属水平上不同生长阶段特定的肠道菌群，发现克雷伯菌属、劳尔氏菌属、肠杆菌属和球链菌属等10个菌属为出生0d的特异性菌属；芽孢杆菌属、肠球菌属、放线菌属、考拉杆菌属、消化链球菌属和消化球菌属等 27个菌属为出生16d的特异性菌属；乳杆菌属、瘤胃球菌属、密螺旋体属、普氏菌属、动弯杆菌属和粪球菌属等51个菌属为出生40d的特异性菌属（图6）。
2.6 不同时间点肠道菌群肠型分析
对巴马香猪在出生0、16和40d3个时间点肠道菌群的肠型进行分析，门水平上的菌群分型结果表明优势菌群结构近似的样品聚成3类，在出生0d肠道微生物主要是变形菌门，16d主要是厚壁菌门，40d主要是厚壁菌门（图7-A）。属水平上的菌群分型表明，优势菌群结构近似的样品聚成3类，出生0d肠道微生物主要是埃希氏菌属-志贺氏菌属，16d主要是埃希氏菌属-志贺氏菌属，40d主要是乳杆菌属（图7-B）。
2.7 肠道菌群组功能预测分析
使用 PICRUSt 对微生物进行功能预测发现，肠道菌群的功能随着巴马香猪的生长发育呈动态变化，其中癌症、神经退行性疾病、药物抗性等代谢途径在0d丰度最高，随后呈下降趋势，相反的免疫系统、其他次生代谢产物生物合成、复制和修复等途径呈上升趋势，并在40d时丰度最高（图8）。
3 讨论
猪胃肠道拥有多样和复杂的微生物群落。而肠道菌群的组成不是一成不变的，其组成和生态演替由许多复杂的内部和外部因素决定。动物胃肠道在出生后不久就开始有微生物定殖，并且随着时间的推移逐渐稳定。肠道菌群结构的变化会影响猪的健康状况和生长性能。Yang等对腹泻仔猪粪便微生物群的宏基因组分析显示，腹泻与普氏菌属、苏氏菌属、弯曲菌属和梭杆菌科细菌的相对丰度增加有关。因此，了解猪生长发育过程中肠道菌群的变化至关重要。本研究采集巴马香猪0d（初生）、16d（哺乳期）和40d（保育期）3个生长阶段的粪便样品，分析巴马香猪生长发育过程中肠道微生物组微生物演替。
本研究结果显示，从巴马香猪3个发育阶段肠道菌群的 Alpha 多样性来看，从刚出生到16d时，仔猪的肠道菌群多样性就已经显著增加，并在保育时多样性达到最高水平。众所周知，多样性可以改善肠道菌群的稳定性和功能，特别是肠道菌群多样性已被认为可以作为一种新的健康和代谢能力的生物标志物。Mi 等研究发现，小型猪肠道菌群 Alpha 多样性随着年龄的增长而急剧增加，增加到20周左右，然后在整个生命中略有波动。对人类婴儿肠道菌群的研究也发现类似的多样性结果。这表明新生仔猪肠道菌群的发育规律与人类基本一致，暴露于环境中的各种细菌下，其肠道菌群的数目和多样性会快速增加，这也是肠道菌群发育的关键。PCoA 分析结果也表明，从出生 0~40 d 的不同时间点肠道菌群的组成不同，说明肠道菌群群的结构和组成可能会随着时间的推移而发生很大变化。
在生长发育过程中，哺乳动物肠道菌群的发育受品种、年龄和饮食影响，并在成熟时达到稳定。本研究结果表明，巴马香猪个生长阶段肠道菌群的优势门为厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门。Pajarillo等通过 16S rRNA 基因测序探讨杜洛克、长白猪和约克郡猪3个纯种猪品系粪便微生物群落的异同，发现在门水平上，无论猪的品种如何，大部分序列都被划分为厚壁菌门和拟杆菌门。但在猪的发育过程中肠道菌群丰度会发生变化。本研究发现，在门水平，厚壁菌门和拟杆菌门在不同生长阶段呈逐渐升高的趋势。Ban-Tokuda 等研究发现，随着育肥猪体重的增加厚壁菌门丰度显著升高，而拟杆菌门丰度显著降低。Guo 等研究发现，肥胖猪和较瘦猪的厚壁菌门水平没有显著差异，而肥胖猪的拟杆菌门水平低于较瘦猪。然而，Schwiertz等报道，超重和肥胖受试者具有更高水平的拟杆菌门。显然，这些在门水平的发现是相当有争议的，需要更多的研究进行说明。本研究还发现，包括多种病原菌的变形菌门在初生 0 d 时丰度最高，但随着年龄的增长而逐渐下降，表明潜在的病原体可能主要存在于新生仔猪的胃肠道中，导致新仔猪更容易患病。
在属水平，瘤胃球菌属在哺乳期出现，并在育肥期丰度达到最高。瘤胃球菌属是肠道中丁酸的主要生产者，其可为肠道上皮细胞提供约70%的能量。丁酸是短链脂肪酸的一种，已被证明对哺乳动物的肠道发育和维持肠道健康有益，并具有免疫防御功能。产生丁酸的主要细菌是厌氧菌，而肠道中较低的氧气浓度为厌氧菌创造了有利环境，同时，被上皮吸收和代谢的丁酸可以消耗肠道中氧气，从而稳定缺氧诱导因子（HIF，一种协调屏障保护的转录因子），保护上皮的屏障功能。此外，本研究发现，乳酸杆菌属虽然在3个时期都存在，但其丰度在育肥期达到最高。这可能是因为从哺乳期到育肥期，仔猪的采食方式由原来吮吸母乳转为采食较难消化吸收的固态颗粒饲料，因此需要更多、能够促进动物消化的乳酸杆菌属，也从侧面说明了乳酸杆菌属对于维持仔猪肠道细菌的稳定和提高仔猪对环境适应性的有益作用。
本研究利用 LEfSe 分析鉴定了不同日龄巴马香猪肠道菌群在属水平上的特异性微生物，发现 0 d 的肠道特异性菌属主要为克雷伯菌属、肠杆菌属和球链菌属等10 个菌属。先前研究发现，刚出生时，肠杆菌属、葡萄球菌属和肠球菌属等好氧菌和兼性厌氧菌最先定植于新生仔猪肠道内。肠道中的氧气被这些细菌消耗殆尽，为专性厌氧菌的定植和增殖提供了有利条件。随后，专性厌氧菌消化链球菌属和消化球菌属等为 16 d 的特征性菌属。营养摄入的方式对肠道菌群的发育有很大影响。如当仔猪从母乳喂养转变到固体饮食时其肠道菌群中与消化纤维相关的微生物丰度明显变化。本研究发现，瘤胃球菌属和普氏菌属成为出生40 d 时的特异菌属。Wang 等研究发现，普氏菌属在哺乳期的丰度较低，断奶后显著增加，在保育期和生长期的丰度继续升高，在育肥期的丰度下降。普氏菌属是拟杆菌门的革兰氏阴性厌氧菌，可发酵膳食纤维产生短链脂肪酸。短链脂肪酸对哺乳动物的能量代谢有非常积极的影响，哺乳动物将短链脂肪酸和葡萄糖一起作为代谢燃料。肠道菌群与宿主的消化功能和饮食方式关系密切，共同对宿主的生长和发育产生重要影响。
本研究 KEGG 功能预测分析发现，肠道菌群的功能随着仔猪的生长发育呈动态变化，其中癌症、神经变形疾病、药物抗性等代谢途径在 0 d 丰度最高，随后呈下降趋势。说明在刚出生时仔猪胃肠道稚嫩，肠道微生物未发育完全，多样性较低，容易受到病原体的侵害。相反，随着仔猪的生长发育，免疫系统、其他次生代谢产物生物合成、复制和修复等途径呈上升趋势，并在 40 d 时丰度最高。Mi等研究也发现，萜类和多酮类等次生代谢的相对丰度均随着年龄的增加而显著增加。说明随着生长发育，肠道菌群多样性增加，与营养物质消化相关的微生物丰度增加，促进营养物质的代谢和吸收，维持机体的健康和正常发育。
4 结论
本研究以地方品种巴马香猪为试验对象，对其3个不同生长阶段的肠道菌群多样性和功能变化进行分析，发现仔猪肠道微生物组的多样性随着年龄的增长而显著增加，特定肠道微生物的相对丰度随着年龄的增长而动态变化，如在属水平，好氧菌和兼性厌氧菌最先出现在初生仔猪的肠道中，随后被专性厌氧菌所代替；随着年龄增长和肠道菌群的发育，肠道菌群功能也发生明显变化。本研究扩展了对猪生长过程中肠道菌群动态迁移的了解，为研究仔猪肠道菌群定植以及演替的变化规律提供理论参考。
来源：中国畜牧杂志
作者：田威龙，刘笑笑，程锋，綦文晶，陈奎蓉，李月月，吕冬玲，梁靓，兰干球，梁晶
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