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H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及免疫试验


现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2022/1/6 16:29:25 关注:58 评论: 我要投稿

摘要:为了更好防控H9N2亚型禽流感,且做到科学免疫,免疫减负。本研究采集疑似感染低致病禽流感鸡群病料,将其无菌处理后接种SPF鸡胚后进行病毒分离,通过分子生物学试验对其进行病原学鉴定。结果显示:分离鉴定出一株H9亚型禽流感病毒(AIV);血凝试验(HA)效价在10~11,该病毒属于欧亚分支的BJ亚分支。将病毒纯化后,制备灭活疫苗免疫SPF鸡,免疫后14d对其进行HI检测,结果显示其效价到达峰值为10Log2,免疫后28~35d其平均效价在9.6Log2,至免疫后12周平均效价在7Log2。结果说明本研究分离的病毒制备成疫苗后具有较好的免疫效果,可以作为疫苗候选株。

关键字:H9N2亚型禽流感毒株,免疫,疫苗

禽流感是禽流行性感冒(avian Influenza,AI)的简称,是由正粘病毒科(orthomyxoviridae)、流感病毒属(influenza virus)、A型流感病毒(influenza A virus)引起的禽类疾病。国际兽医局(OIE)将禽流感列为A类动物疫病,我国也将其定为一类动物传染病。

H9N2禽流感病毒是低致病性亚型,在世界各地家禽群中流行。目前,H9N2引起的禽流感在我国呈地方流行,虽然死亡率低,但感染蛋鸡出现鸡输卵管功能异常,产褪色蛋、畸形蛋、砂皮蛋、软壳蛋,鸡群产蛋率下降30%~80%,病程持续时间长的可达月余,造成严重的经济损失。该疾病可通过免疫疫苗进行抵御但是由于低致病禽流感变异速度快,不同血清型之间交叉保护有限;所以筛选、免疫对型疫苗对养殖业具有重要意义。本研究通过分子病原学及血清学分离鉴定一株H9N2流行毒株,并进行动物试验,为进一步筛选疫苗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 疑似发病鸡病料,采集自宁夏平罗县某商品蛋鸡养殖场。

1.1.2 试剂和设备 禽流感抗H9亚型标准阳性血清由哈尔滨兽医研究所提供;One Step PCR Mix购自北京全式金生物;PCR仪购自罗氏;RNA提取试剂盒购自罗氏;高速冷冻离心机购自湘仪。

1.1.3 试验动物 试验用SPF鸡种蛋,购自北京勃林格英格翰公司

1.1.4 引物设计 参照GenBank中已发表的H9N2AIV的HA基因序列,设计一对鉴定引物,序列为:AI-F(5'-3'):CTCCACACAGAGCAYAATGG;AI-R(5'-3'):GYACACTTGTTGTTGTRTC;扩增基因片段大小均为488bp。测序引物系列:HA-F(5'-3'):AGCRAAAGCAGGGGAATTTC;HA-R(5'-3'):AGTAGAAACAAGGGTGTTTT;扩增基因片段大小均为1800bp。引物由上海生工生物技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒基因组RNA提取 采集疑似发病鸡群病料及肛咽拭子;将其无菌处理后,根据罗氏病毒RNA提取试剂盒操作步骤,提取核酸。使用鉴定引物根据全式金生物一步法进行PCR扩增,扩增程序为:94℃ 2min;94℃ 30s,53℃ 30s,72℃ 2min,30个循环;72℃ 10min;扩增完毕后进行凝胶电泳,观察是否有目的片段。

1.2.2 病毒分离及鉴定 将1.2.1无菌处理的肛咽拭子样品吸取上清,使用0.22μm滤器过滤,以0.2mL/只接种9~10日龄SPF鸡胚,弃去24h内死亡鸡胚,将24~96h死亡和存活鸡胚放于4℃过夜或放于-20℃ 2h后无菌收集尿囊液。检测尿囊液效价,对于有效价尿囊液重复1.2.1操作,扩增完毕后进行凝胶电泳,观察是否有目的片段;无效价尿囊液重复接种鸡胚。

1.2.3 序列测定、同源性分析 将含有目的片段的PCR产物送至上海生工进行测序分析。测序结果经过整理、拼接,获得完整的HA基因序列。利用MEGA4及MegAlign软件进行分析。

1.2.4 免疫血清的制备 将收获的鸡胚尿囊液按油乳剂疫苗的制备方法制备灭活疫苗,检验合格后,经胸肌接种20只21日龄SPF鸡,0.5mL/只,同时设空白对照组。于免疫后2周、4周、6周、8周、12周采血,分离血清,分别保存备用。

2 结果

2.1 PCR反应与序列鉴定

病料样品处理后接种9~10日龄SPF鸡胚,在培养的72h内未出现鸡胚死亡,72h后测其尿囊液,HA效价为10log2,并且HA阳性尿囊液的血凝性能够被AIV-H9标准阳性血清所抑制,而不能被抗NDV、EDSV、AIV-H5阳性血清所抑制,表明该分离株为H9亚型AIV。进一步利用H9鉴定引物对分离株HA基因进行扩增,得到与预期大小(约488bp)相符片段(见图1)。同时利用测序引物进行扩增送至上海生工技术公司进行测序,测序结果经BLAST比对分析发现,与其匹配度高的几种序列全部为H9亚型禽流感序列,根据MEGA4及MegAlign软件分析,结果显示该病毒与欧亚BJ亚分支同源性99.8%~95.0%,进一步证实该分离株为H9亚型禽流感。

 

 


2.5 免疫试验结果

免疫后2周抗体效价上升至10Log2,显著高于国标的6.5log2,免疫后4~5周抗体效价维持在9.6Log2滴度,具有较好的保护力度。随后抗体效价逐渐消减,至免疫后12周抗体效价水平维持在7Log2。

3 讨论

1994年,我国分离到第一株H9N2亚型禽流感病毒后,H9N2亚型禽流感病毒在我国禽类中广泛流行,对养禽业造成了巨大经济损失。鸡群感染H9亚型禽流感后产蛋率下降较明显,所以养殖业对H9亚型禽流感病毒的防控十分重视。本试验通过病毒分离,血清学试验为选用H9疫苗提供依据,同时为防控H9N2亚型禽流感提供新思路。

参考文献:略

作者:许佳敏/新疆阜康市城关镇农业(畜牧业)发展服务中心

来源:《中国动物保健》2021年1月刊


文章来源:中国动物保健     文章编辑:一米优讯     
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