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摘要：为了更好防控H9N2亚型禽流感，且做到科学免疫，免疫减负。本研究采集疑似感染低致病禽流感鸡群病料，将其无菌处理后接种SPF鸡胚后进行病毒分离，通过分子生物学试验对其进行病原学鉴定。结果显示：分离鉴定出一株H9亚型禽流感病毒（AIV）；血凝试验（HA）效价在10～11，该病毒属于欧亚分支的BJ亚分支。将病毒纯化后，制备灭活疫苗免疫SPF鸡，免疫后14d对其进行HI检测，结果显示其效价到达峰值为10Log2，免疫后28～35d其平均效价在9.6Log2，至免疫后12周平均效价在7Log2。结果说明本研究分离的病毒制备成疫苗后具有较好的免疫效果，可以作为疫苗候选株。
关键字：H9N2亚型禽流感毒株，免疫，疫苗
禽流感是禽流行性感冒（avian Influenza，AI）的简称，是由正粘病毒科（orthomyxoviridae）、流感病毒属（influenza virus）、A型流感病毒（influenza A virus）引起的禽类疾病。国际兽医局（OIE）将禽流感列为A类动物疫病，我国也将其定为一类动物传染病。
H9N2禽流感病毒是低致病性亚型，在世界各地家禽群中流行。目前，H9N2引起的禽流感在我国呈地方流行，虽然死亡率低，但感染蛋鸡出现鸡输卵管功能异常，产褪色蛋、畸形蛋、砂皮蛋、软壳蛋，鸡群产蛋率下降30%～80%，病程持续时间长的可达月余，造成严重的经济损失。该疾病可通过免疫疫苗进行抵御但是由于低致病禽流感变异速度快，不同血清型之间交叉保护有限；所以筛选、免疫对型疫苗对养殖业具有重要意义。本研究通过分子病原学及血清学分离鉴定一株H9N2流行毒株，并进行动物试验，为进一步筛选疫苗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料来源 疑似发病鸡病料，采集自宁夏平罗县某商品蛋鸡养殖场。
1.1.2 试剂和设备 禽流感抗H9亚型标准阳性血清由哈尔滨兽医研究所提供；One Step PCR Mix购自北京全式金生物；PCR仪购自罗氏；RNA提取试剂盒购自罗氏；高速冷冻离心机购自湘仪。
1.1.3 试验动物 试验用SPF鸡种蛋，购自北京勃林格英格翰公司
1.1.4 引物设计 参照GenBank中已发表的H9N2AIV的HA基因序列，设计一对鉴定引物，序列为：AI-F（5'-3'）：CTCCACACAGAGCAYAATGG；AI-R（5'-3'）：GYACACTTGTTGTTGTRTC；扩增基因片段大小均为488bp。测序引物系列：HA-F（5'-3'）：AGCRAAAGCAGGGGAATTTC；HA-R（5'-3'）：AGTAGAAACAAGGGTGTTTT；扩增基因片段大小均为1800bp。引物由上海生工生物技术有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 病毒基因组RNA提取 采集疑似发病鸡群病料及肛咽拭子；将其无菌处理后，根据罗氏病毒RNA提取试剂盒操作步骤，提取核酸。使用鉴定引物根据全式金生物一步法进行PCR扩增，扩增程序为：94℃ 2min；94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 2min，30个循环；72℃ 10min；扩增完毕后进行凝胶电泳，观察是否有目的片段。
1.2.2 病毒分离及鉴定 将1.2.1无菌处理的肛咽拭子样品吸取上清，使用0.22μm滤器过滤，以0.2mL/只接种9～10日龄SPF鸡胚，弃去24h内死亡鸡胚，将24～96h死亡和存活鸡胚放于4℃过夜或放于-20℃ 2h后无菌收集尿囊液。检测尿囊液效价，对于有效价尿囊液重复1.2.1操作，扩增完毕后进行凝胶电泳，观察是否有目的片段；无效价尿囊液重复接种鸡胚。
1.2.3 序列测定、同源性分析 将含有目的片段的PCR产物送至上海生工进行测序分析。测序结果经过整理、拼接，获得完整的HA基因序列。利用MEGA4及MegAlign软件进行分析。
1.2.4 免疫血清的制备 将收获的鸡胚尿囊液按油乳剂疫苗的制备方法制备灭活疫苗，检验合格后，经胸肌接种20只21日龄SPF鸡，0.5mL/只，同时设空白对照组。于免疫后2周、4周、6周、8周、12周采血，分离血清，分别保存备用。
2 结果
2.1 PCR反应与序列鉴定
病料样品处理后接种9～10日龄SPF鸡胚，在培养的72h内未出现鸡胚死亡，72h后测其尿囊液，HA效价为10log2，并且HA阳性尿囊液的血凝性能够被AIV-H9标准阳性血清所抑制，而不能被抗NDV、EDSV、AIV-H5阳性血清所抑制，表明该分离株为H9亚型AIV。进一步利用H9鉴定引物对分离株HA基因进行扩增，得到与预期大小（约488bp）相符片段（见图1）。同时利用测序引物进行扩增送至上海生工技术公司进行测序，测序结果经BLAST比对分析发现，与其匹配度高的几种序列全部为H9亚型禽流感序列，根据MEGA4及MegAlign软件分析，结果显示该病毒与欧亚BJ亚分支同源性99.8%～95.0%，进一步证实该分离株为H9亚型禽流感。
2.5 免疫试验结果
免疫后2周抗体效价上升至10Log2，显著高于国标的6.5log2，免疫后4～5周抗体效价维持在9.6Log2滴度，具有较好的保护力度。随后抗体效价逐渐消减，至免疫后12周抗体效价水平维持在7Log2。
3 讨论
1994年，我国分离到第一株H9N2亚型禽流感病毒后，H9N2亚型禽流感病毒在我国禽类中广泛流行，对养禽业造成了巨大经济损失。鸡群感染H9亚型禽流感后产蛋率下降较明显，所以养殖业对H9亚型禽流感病毒的防控十分重视。本试验通过病毒分离，血清学试验为选用H9疫苗提供依据，同时为防控H9N2亚型禽流感提供新思路。
参考文献：略
作者：许佳敏/新疆阜康市城关镇农业（畜牧业）发展服务中心
来源：《中国动物保健》2021年1月刊
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