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摘要：为了解进口饲料中沙门氏菌的耐药情况，分离、鉴定进口饲料中的沙门氏菌，采用药敏试剂盒对分离的沙门氏菌菌株进行了14种抗菌药物的敏感性试验。结果显示，从进口饲料中分离鉴定出的148株沙门氏菌对14种抗菌药物的敏感率均在93%（138/148）以上，对阿奇霉素完全敏感；148株沙门氏菌中有8株具有耐药性，以多重耐药为主，分离自7个国家和地区的样品。结果说明，进口饲料中沙门氏菌耐药率相对较低，但部分国家样品中的沙门氏菌存在耐药，而且多为多重耐药。建议加强进口饲料中的沙门氏菌及其耐药性监测，防止国外沙门氏菌，特别是耐药沙门氏菌的传入。
沙门氏菌作为人和动物的主要致病菌之一，可导致鸡白痢、仔猪副伤寒、动物流产等疾病，还能使人类出现胃肠炎、伤寒、败血症及肠外灶性感染和食物中毒等多种症候群。自1885年美国兽医师Daniel E Salmon首次分离到猪霍乱沙门氏菌以来，沙门氏菌病发病率不断上升，给世界各国造成了巨大经济损失。
抗菌药物的使用，在预防和控制沙门氏菌病方面发挥了巨大作用。但随着抗菌药物的大量不合理使用甚至滥用，沙门氏菌耐药株及多重耐药株不断出现，耐药问题日趋严重。已有报道表明，沙门氏菌可对多种抗菌药物产生耐药，且动物沙门氏菌的耐药率逐年升高。整个沙门氏菌属的多重耐药率已从20世纪90年代的20%~30%增加到了21世纪初的70%。
药物敏感试验（简称药敏试验）是指抗菌药物在体外对病原体有无抑制或杀灭作用的试验。各种细菌对不同抗菌药物的敏感性不同，同一种细菌中不同菌株的药物敏感性也常有差异。药敏试验结果对临床合理选用抗菌药物有重要的参考价值。为测定微生物对某一抗感染药的敏感性，通常应用最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）表示，MIC值越高说明微生物对该抗菌药物的敏感性越低。
尽管关于沙门氏菌耐药性的研究很多，但目前关于进口饲料中沙门氏菌耐药性的检测研究较少。本试验拟对进口饲料中分离的沙门氏菌进行临床常用抗菌药物敏感性试验，了解其中的沙门氏菌污染及其耐药情况，从而为进出口沙门氏菌病防控提供依据。
材料与方法
试验材料
样品 2013—2020年从上海口岸进口的饲料，包括鱼粉、鸡肉粉、肉骨粉、宠物食品、苜蓿草、菜籽粕、乳清粉、奶酪粉、牛油、血球蛋白粉、制成的饲料添加剂等。样品来自美国、厄瓜多尔、巴基斯坦、巴拿马、荷兰、新加坡、秘鲁、韩国、越南、泰国、智利、澳大利亚、阿根廷、乌拉圭、毛里求斯等多个国家和地区。
试剂 缓冲蛋白胨水（BPW）、氯化镁孔雀绿（RV）增菌液、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、亚硫酸铋（BS）琼脂、胆硫乳（DHL）琼脂、沙门氏菌显色培养基（SA）、营养琼脂（NA）等，均购自北京陆桥技术股份有限公司；革兰氏阴性需氧菌药敏检测试剂盒，购自上海星佰生物技术有限公司。
仪器设备 培养箱（36±1）℃，RS Biotech公司；培养箱（42±1）℃，上海博迅公司；VITEK 2 compact微生物快速分析系统，梅里埃公司；细菌浊度仪，BIOLOG公司。
分离鉴定
参照《饲料中沙门氏菌的测定方法》（GB/T 13091—2018），同时采用VITEK 2 compact微生物快速分析系统鉴定。
药敏试验
采用革兰氏阴性需氧菌药敏试剂盒，对沙门氏菌分离株进行14种临床常用抗菌药物的MIC值测定。测试药物为氨苄西林（AMP）、头孢他啶（CAZ）、氨苄舒（AMS）、亚胺培南（IMP）、四环素（TET）、萘啶酸（NAL）、头孢西丁（CFX）、氯霉素（CHL）、头孢噻肟（CTX）、头孢唑林（CFZ）、庆大霉素（GEN）、复方磺胺（SXT）、阿奇霉素（AZM）、环丙沙星（CIP）。每块药敏板上，对每种抗菌药物都设有一系列倍比稀释浓度的试剂（表1）。样本为处于对数生长期的纯化菌落，通过加入待检细菌与肉汤培养液稀释的菌悬液，经18~24 h孵育后，肉眼判读MIC值（表2），并根据美国临床实验室标准化委员会（CLSI）的相应标准获得相应敏感（S）、中度敏感（I）和耐药（R）的结果。
菌液制备 挑取菌落数个，置于2~3 mL灭菌生理盐水中，用0.5麦氏比浊管进行比浊，调制菌液浓度为1.5×108 cfu/mL左右。
稀释 取上述菌液60 ?L，滴入无菌加样槽中，加营养肉汤培养液1支（12 mL），混匀。
加样 用8通或12通微量移液器，吸取稀释菌液100 ?L，加入除阴性对照孔以外的95孔微量药敏板，阴性对照孔加无菌营养肉汤培养液100 ?L。
培养 将板条放入恒温培养箱中36 ℃培养18~24 h。显色药敏板中包含细胞生长类指示剂，通过细胞生长代谢过程中NADH发生电子转移，使指示剂发生氧化还原反应进而变色。蓝色、蓝紫色、深紫色为阴性反应，粉色、淡粉色、红色、紫红色为阳性反应（图1）。
结果判读 自培养箱中取出板条，用干毛巾轻轻擦拭板条底部，肉眼判读各个孔的阴阳性结果。
结果
病原分离鉴定
参照《饲料中沙门氏菌的测定方法》（GB/T 13091—2018），对2013—2020年上海口岸进口饲料中的沙门氏菌进行分离鉴定，共分离鉴定出148株沙门氏菌。
耐药性试验
148株沙门氏菌分离株对各种抗菌药物的敏感性试验结果显示，有8株沙门氏菌呈现不同程度的耐药（表3）。其余140株沙门氏菌分离株对被检药物均表现为敏感（某分离株检测结果见图2）或中度敏感。其中沙门氏菌对NAL耐药率最高，为4.73%，其次是AMP、TET、SXT、CIP，耐药率均为3.38%，对其他抗菌药物的耐药率依次是CHL＞AMS＞GEN＞头孢类＞IMP、AZM。对CAZ、CFX、CTX和CFZ 4种头孢类抗菌药物耐药率均为0.68%，对IMP和AZM的耐药率最低，为0。考虑到IMP的中度敏感率为0.68%，所以14种抗菌药物中，敏感性最高的是AZM，敏感率为100%（表4）。
多重耐药情况
分离到的8株沙门氏菌耐药菌株，仅有2株分别对TET和NAL耐药，其余6株均表现为多重耐药，占75%（6/8）。多重耐药以7重耐药为主，占50%（3/6），其耐药谱型分别为AMP-AMS-TET-NAL-CHL-SXT-CIP，AMP-AMS-TET-NAL-CHL-SXT-CIP和AMP-TET-NAL-CHL-GEN-SXT-CIP；3、6和8重耐药菌株（图3）各1株，其耐药谱型分别为AMP-NAL-SXT、CAZ-NAL-CFX-CTX-CFZ-CIP、AMP-AMS-TET-NAL-CHL-GEN-SXT-CIP（表5）。
讨论
近年来，抗菌药在生产实践中的广泛应用使得沙门氏菌耐药性问题日益突出，成为世界性难题。为了解沙门氏菌耐药现状，遏制沙门氏菌耐药性蔓延，我国各地学者对沙门氏菌的耐药性进行了密切监测和研究。陆彦等对山东省不同来源分离的鸡源沙门氏菌进行了19种药物敏感性测定，发现178株分离株中，对AMP和TET的耐药率均在66%以上，对SMZ和NAL耐药率达到100%；赵建梅等对2008—2017年从山东、河北等地分离的71株菌进行药敏试验，发现禽源沙门氏菌对AMP和SIZ耐药情况严重，耐药率高于70%；黄凯等对临床上疑似患沙门氏菌病的病料进行病原分离，共鉴定出61株沙门氏菌，药敏试验发现所有菌株对PG、ERY、VAN耐药，90.16%的分离株对6种及以上抗菌药耐药。
从本试验结果来看，进口饲料中沙门氏菌耐药性相对较低，所检的14种抗菌药物敏感率都在93%以上，但仍存在个别菌株耐药情况。尤其是多重耐药菌株占75.00%（6/8），6重耐药以上菌株占62.50%（5/8），且耐药谱各不相同，这给该病防治带来了更大的难度和挑战。抗菌药的不合理使用，不仅可导致沙门氏菌耐药性提高，且能增加多重耐药沙门氏菌的传播概率。菌株耐药率与在生产实践中抗菌药的使用密切相关，因此有必要继续加大对抗菌药使用的监管力度。
本试验分离到的8株耐药菌株，从分离年份看，其中4株分离自2014年，2株分离自2015年，剩余2株分离自2016和2018年。整体来看，进口饲料中沙门氏菌耐药率有逐年下降的趋势，推测原因可能为国外企业对饲料中沙门氏菌污染问题较为重视，我国海关出入境检疫部门严格把关。从分离国家看，8株耐药菌株分别来自毛里塔尼亚、越南、美国、毛里求斯、韩国、厄瓜多尔和澳大利亚等7个国家，提示沙门氏菌耐药及多重耐药现象仍面临世界性蔓延风险，这给畜牧业生产和公共卫生安全带来严峻挑战。
饲料安全不但关系到被饲喂动物的安全和生产效率，而且间接影响人类的健康和生命安全。随着对外贸易的不断发展，饲料的进口数量和种类日益增加，饲料安全问题也越加引起社会关注。引进境外饲料可以优化营养配比，但同时也可能引进带有疫病风险的饲料，从而直接进入我国动物饲养的食物链，危害深远。因此，我国海关出入境检疫部门应加强进口饲料的沙门氏菌监测，对不合格的饲料及时隔离或销毁，这对防止国外沙门氏菌传入，保护国内人畜健康有着十分重要的意义。
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