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鸡传染性支气管炎诊断技术研究进展
现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2022/4/16 8:17:42 关注：1564 评论： 我要投稿
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摘要：鸡传染性支气管炎（avian infectious bronchitis，IB）具有极强的传染性，为我国二类动物疫病。IB的准确诊断对其防控具有极其重要作用。本文综述了病毒分离、血清学诊断、免疫组织化学技术、分子生物学诊断、蛋白芯片技术等主要的IB诊断方法。病毒分离是诊断IB的重要手段，但其耗时长且对操作有一定要求，因此近年来将其与基因测序分析相结合来进行IB诊断及基因型鉴别；在常规血清学方法中，酶联免疫吸附试验（ELISA）和血凝抑制试验（HI）是推荐用于鸡群大规模筛查及免疫效果评价的方法，病毒中和试验（VNT）具有高度特异性，常被应用于毒株的变异鉴定，但是耗时且缺乏标准化，建议选用更成熟的ELISA方法；随着分子生物学技术的发展，聚合酶链式反应（PCR）因具有更高的准确性，且能实现实时定量分析，已被广泛应用于实验室检测；重组聚合酶等温扩增技术（RPA）特异性好，对试验条件要求不高，适用于养殖场的大规模IB筛查。另外，蛋白芯片技术、免疫层析试纸条、鸡声信号分析装置也为IB诊断提供了全新的思路。
鸡传染性支气管炎（avian infectious bronchitis，IB）是目前影响家禽养殖的重要疾病之一，能造成鸡死亡，蛋鸡产蛋量下降，肉鸡饲料转化率降低，具有极强的传染性，为我国二类动物疫病。IB是由冠状病毒科γ冠状病毒属传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）引起的，以呼吸道、生殖道以及肾脏发生病变为主的急性高度接触性传染病。IBV除了能感染不同日龄的鸡外，也能感染火鸡、鸭、孔雀、鸽子、鹌鹑等。20世纪80年代以来，IB已经在我国广泛流行，特别是在鸡养殖密集型地区，且流行的病毒基因型呈现多样性和复杂性。本文综述了IB的流行病学、临床症状和剖检特征，以及近年来在诊断技术方面的研究进展，以期为IB的诊断提供一定的参考。
流行病学
IBV自1931年被首次报道至今，已经在全球流行传播。对全球176个国家的禽病调查发现，IBV造成的禽类死亡数仅次于高致病性禽流感。IBV主要通过空气传播，也可通过接触病禽及其排泄物以及受污染的物品传播流行。当外界环境温度较低时，圈舍较封闭，空气流通慢，此时易造成IBV大范围传播。因此，每年10月到次年4月是IB的高发期。
IBV复制所需的RNA聚合酶无校对功能，因而在其复制过程中容易发生基因突变、缺失、重组或外源基因插入，导致IBV不断变异并出现了众多的基因型和血清型。目前我国流行的主要毒株为QX（GI-19）、4/91（GI-13）、TW（GI-7）、MASS（GI-1），其中QX是优势毒株。我国的IBV流行具有明显的地域性特征，主要流行于禽类养殖较为密集的中东部和南方地区。流行病学调查发现，我国南方和华中地区商品鸡养殖场普遍存在多个基因型IBV毒株，包括重组毒株，其中QX、TW、4/91是最常见的基因型，而TW流行呈上升趋势。
临床症状及剖检特征
所有日龄的鸡均能感染IBV，潜伏期一般为18~36 h，其中30日龄以内的鸡发病率高，随着日龄的增加发病率随之降低。IBV还会诱发其他疾病进而导致死亡率增加。感染IBV的病鸡表现为精神萎靡、流泪、羽毛蓬乱、采食量减少、大量饮水、腹泻，根据症状的差异，被分为肾型、呼吸道型、生殖型。该病主要影响呼吸道和生殖系统。近年来，我国肾型病例发病率有所上升，且病毒毒力和传播能力更强。
呼吸型主要表现为呼吸道炎症，包括气管啰音、流鼻涕、咳嗽、喘息、打喷嚏，剖检见气管黏膜和支气管黏膜充血并伴有大量的黏液和气泡；生殖型主要表现为产蛋量下降、蛋品质下降（畸形、软壳、蛋黄水状），剖检见输卵管损伤、腹腔内卵黄液聚集；肾型剖检常见肾脏苍白肿大、肾炎、尿酸沉积、坏死。此外，法氏囊、哈德氏腺、肺脏、脾脏、腺胃、肠道、睾丸也是IBV复制的场所，因此会表现出不同程度的病变，如法氏囊肿大、脾脏充血、腺胃出血性溃疡、附睾结石等，往往表现出复杂的混合症状。IB的临床症状与禽流感（avian?influenza，AI）、新城疫（Newcastle disease，ND）、传染性喉气管炎（infectious?laryngotracheitis，ILT）的症状有一定的相似性，因此需借助实验室手段进行确诊。
诊断方法
病毒分离鉴定
病毒分离是诊断IB的重要手段。由于支气管是IBV感染的主要部位，且1周内会达到病毒滴度的峰值，因此对疑似患病鸡要及时采集气管拭子或新鲜气管组织进行病毒分离。肾脏、腺胃、输卵管、泄殖腔、盲肠扁桃体也是重要的采样部位。鸡胚接种是分离IBV的首选方法，其缺点是只有连续传3代以上才会出现特征性病变——胚胎卷曲和萎缩，但这并不能作为确诊的依据，还需进一步依靠血清学方法或分子生物学方法确诊。尽管鸡胚肾成纤维细胞、肾上皮细胞和Vero细胞已经被应用于分离IBV，但是并不是所有的IBV毒株都能通过细胞培养被分离。器官培养也是一种重要的分离手段，气管环样品是优先选择。随着IBV的复制，纤毛运动逐渐减弱，因此显微镜下观察到纤毛运动停止是判定IBV为阳性的重要依据，但是也可能会出现假阴性。病毒分离耗时且对操作环境有一定的要求，因此该方法并不适用于常规诊断，主要用于减毒疫苗研发、测序前病毒浓度提高、致病力测试、疫苗保护力研究等。
血清学诊断
酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） ELISA是目前应用最广泛的IBV抗体血清学检测方法，常用完整的IBV病毒粒子和重组蛋白作为抗原。哈尔滨兽医研究所已经开发出检测结果可靠、成本低的ELISA抗体检测试剂盒，能在短时间内进行大规模筛查。一般建议在疑似感染时和1周后各检测1次。ELISA检测成本低、简便易操作，能应用于早期和长期感染时的抗体检测。苗立中等依靠截短表达的S1蛋白开发的间接ELISA抗体检测方法，可应用于IBV免疫抗体检测和感染快速诊断。将基于IBV S蛋白保守序列的合成肽与ELISA结合，能特异性检测不同基因型的IBV抗体。Finger等将ELISA与蛋白质印迹法（western blot，WB）相结合检测IBV N蛋白抗体，发现该方法的敏感性和特异性均大于90%，还能检测到商品试剂盒检测不到的抗体，将ELISA与WB结合起来能有效提高诊断的灵敏度，降低假阴性出现的概率。
血凝抑制试验（heamagglutination inhibition test，HI） IBV无血凝素，不能凝集动物红细胞，因此需要进行特殊处理使其具有血凝活性。Hussian等对比胰蛋白酶、神经氨酸酶、磷脂酶C处理制备的抗原，发现经磷脂酶C处理制备的抗原更适合用于HI快速诊断IBV。庄金秋等将鸡胚培养增殖的IBV M41株尿囊液上清，经聚乙二醇处理后与魏氏梭菌（含α毒素）按一定比例混合处理后制成HI抗原，发现该抗原效价好、稳定性可靠，可以应用于鸡群IBV疫苗免疫后血清抗体及卵黄抗体的检测。HI成本低、所需设备简单、耗时较短，不仅能应用于大规模鸡群的IBV筛查，还能用于疫苗免疫后抗体效果评价。
病毒中和试验（virus neutralization test，VNT） VNT具有高度的特异性，能够区分基因型和测定血清中抗体效价，因此常被应用于IBV的变异鉴定以及疫苗免疫效果评价。常用的操作方法有两种：用已知浓度血清与不同稀释度病毒反应（α法）和用已知病毒量与不同稀释度血清反应（β法），其中α法更准确可靠。Zhou等从H120和4/91免疫鸡群中分离出一株IBV毒株（CK/CH/2010/JT-1），利用VNT发现两种疫苗不能形成有效保护，经测序后发现这是一种新的基因型。VNT比HI更灵敏，但是耗时且缺乏标准化，建议选用更成熟的ELISA。
免疫组织化学技术（immunohistochemistry，IHC）IHC是基于抗原抗体反应，根据标记物的性质差异进行检测的技术。应用于IBV检测的主要分为两种：免疫荧光组织化学技术和免疫酶组织化学技术。这两种是从组织（细胞）样品中检测IBV抗原的重要方法。亲和素-生物素复合物（ABC），已被成功用于组织样本中定位IBV抗原。IHC可以在IBV感染的各个阶段观察到组织的病理变化情况，但是不能有效区分血清型和毒株。通过IHC对两株IBV毒株进行致病力研究，发现IBV S蛋白首先在气囊内侧纤毛细胞中被检测到。Abdel-moneim等应用IHC在接种IBV M41的鸡胚多个组织中检测到IBV抗原，说明IBV具有广泛的组织嗜性。近年来，随着分子生物学的发展，IHC更多的应用于IBV的组织病理学研究，而较少应用于IBV现场诊断和筛查。
分子生物学诊断
反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR） RT-PCR是分子生物学常规的检测方法，通过快速扩增目的片段，结合琼脂糖凝胶电泳实现对病毒的快速诊断。Fellahi等建立了一种SYBR green I RT-PCR检测IBV的方法，与常规RT-PCR相比具有较高的特异性，且灵敏度高10倍，适用于IBV的常规检测。Xiu等建立了能检测包括IBV在内的目前已知的14种冠状病毒的半巢式RT-PCR，检测限为4×（100~102）copies/μL，与测序结果相比具有良好的一致性，但是操作复杂，不适用于大规模筛查。该方法在扩增后还需进行琼脂糖凝胶电泳，操作繁琐、耗时长，因此大规模筛查时建议使用易操作省时的多重PCR或常规RT-PCR。
多重PCR（multiplex polymerase chain reaction） 多重PCR是通过在一个反应体系中加入两对以上引物，实现对多个病原检测的方法。高文倩等将免疫磁珠富集应用于IBV检测，建立了检测IBV强毒株与弱毒疫苗株的多重PCR，经富集后的方法灵敏度提高了100倍，特异性良好，在临床上有较高的应用价值。Laamiri等建立了能同时检测AIV、IBV、NDV和ILTV的多重实时RT-PCR，检测结果与独立检测结果一致。该方法能同时检测4种病原，并且具有耗时短、准确度高的优点，适用于禽类养殖场常规疫病筛查。Cong等首次结合x-TAG磁珠开发了鉴别AIV、NDV、IBV和ILTV的多重PCR，检测限为6.75×102~3.52×103 copies/μL，具有通量高、耗时短、灵敏度高的优点。多重PCR更适用于在疑似混合感染群体中进行筛查，能有效降低筛查成本。
环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP） LAMP针对靶基因的6个区域设计多条特异性引物，能在恒温条件下实现对目的基因的快速扩增。该方法已经广泛应用于病毒检测。由于IBV-S2基因高度保守，因此Chandrasekar等以IBV-S2基因建立了RT-LAMP。该方法仅需在60 ℃条件运行45 min即可完成检测，且敏感度比RT-PCR高100倍；将产物使用碘化丙啶染色即可用肉眼判断结果，阳性为粉红色，阴性为橙红色。该方法灵敏度高、耗时短，可作为基层实验室诊断IBV的方法。El-tholoth等建立了在封闭条件下反应的半定量RT-LAMP，消除了检测过程中的污染问题，检测限为1 EID50/mL，能应用于临床样品的IBV筛查。普通LAMP对染料要求较高，而且操作过程出现污染、引物较多使设计复杂、引物之间杂交等因素都可能造成假阳性。
实时荧光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR） RT-qPCR是一种结合荧光基团实现实时定量的PCR方法。王楷宬等基于IBV核衣壳蛋白基因建立的RT-qPCR的灵敏度可达到10-4 ng/μL，与国家标准方法具有同等的可靠性。金娟等针对IBV-S1基因设计引物和探针，将拷贝数与EID50联系起来，实现对QX型IBV的准确定量。廖凯设计了两套特异性引物和探针，建立了针对TW Ⅰ型的RT-qPCR。该方法对101~109 copies/μL范围内的底物能取得优良的检测效果，且与其他IBV血清型无交叉反应。Karimi等利用RT-qPCR结合4种不同的酶扩增S1基因部分片段，建立了同时检测Mass、793/B、QX和 IS-14194的PCR-RFLP方法。该方法具有与测序相同的特异性，能作为一种简单、快速的方法应用于IBV分型。由于RT-qPCR灵敏度极高，每一个步骤都有可能因为操作不规范造成样品污染或环境污染（特别是当样品中存在强阳性时），因此对操作人员及处理环境有着较高要求。
重组聚合酶等温扩增技术（recombinase polymerase amplification，RPA） RPA技术是一种依赖DNA聚合酶、单链结合蛋白的恒温高效快速扩增技术。El?tholoth等将RT-RPA与核酸层析（nucleic acid lateral flow，NALF）结合，建立了同时检测NDV和IBV的RT-RPA-NALF法。该方法在38 ℃仅需40 min就可以检出两种病毒，并且依靠肉眼就可判断结果，检测限为10 copies/μL。且该方法经过改进后或许可以区分疫苗株和野毒株，与RT-qPCR相比，对条件要求更低且耗时更短，适用于现场快速筛查。Wang等将RT-RPA与横向流动试纸条（lateral flow dipstick，LFD）结合，建立了检测IBV的RT-RPA-LFD。该方法扩增目的基因仅需24 min，并通过LFD可以在3 min内肉眼观察得到结果，检测限为102 copies/μL，灵敏度为104 copies/μL。RPA特异性好，对试验条件要求不高，且灵敏度高、耗时短，适用于养殖场IBV大规模筛查。
蛋白芯片技术
蛋白芯片技术针对蛋白质而开发，主要包括蛋白质微阵列、微孔板蛋白质芯片、三维凝胶块芯片。Li等建立了一种同时检测AIV、NDV和IBV抗体的三重蛋白芯片技术。与商品试剂盒相比，该方法的敏感性、特异性、准确度均大于99%，能应用于现场快速筛查，但是该方法不能区别自然感染和疫苗接种抗体，因此筛查前要调查疫苗接种史。Yan等结合改性聚二甲基硅氧烷（iPDMS）开发了两种间接微阵列芯片技术：化学发光免疫分析试验和快速诊断试验。除判定方法不同外，反应过程与ELISA类似，与商品试剂盒相比，敏感性和特异性均大于90%，其中快速诊断试验能通过肉眼判定且能在15 min得到结果。但是基于蛋白芯片技术研发的产品在灵敏度和特异性上与RT-qPCR、RPA等仍存在一定差距，仍需进一步优化升级。
其他诊断技术
除了上述应用较多的诊断方法，近年来还有Liu等以IBV N蛋白和S蛋白单克隆抗体为示踪剂和捕获抗体，建立了能快速、简便检测IBV的免疫层析试纸条，能在10 min内完成检测。该方法与RT-PCR检测结果具有一致性，结合使用单克隆抗体和胶体金单抗示踪剂是鉴别各种IBV基因型的理想选择。Banakar等依靠数据挖掘方法和Dempster-Shafer理论建立了一种禽病诊断装置，利用快速傅立叶变换（fast fourier transform，FFT）和离散小波变换（discrete wavelet transform，DWT）对鸡声信号进行处理，通过声音数据分析，能够快速诊断出NDV、IBV和AIV。该装置的研发为禽病诊断提供了一种新的思路，但其实用性仍需进一步探究。
结语
IB诊断方法主要有病毒分离、血清学诊断、免疫组织化学技术、分子生物学诊断、蛋白芯片技术。病毒分离耗时长且对操作有一定的要求，因此近年来将病毒分离与基因测序分析相结合已经成为诊断IBV及鉴别其基因型的重要手段。在常规血清学方法中，ELISA和HI是推荐用于鸡群大规模筛查及免疫效果评价的方法，已经有商品化的ELISA试剂盒。IHC已经较少应用于IBV的诊断及筛查。随着分子生物学技术的发展，PCR技术因其更高的准确性，且能实现实时定量分析，已经被广泛应用于实验室检测；RPA技术作为有着极大发展潜力的新技术，将其与NALF或LFD相结合，不仅耗时短，对条件要求低，而且能肉眼判断结果。另外，蛋白芯片技术、免疫层析试纸条、鸡声信号分析装置也为IB诊断提供了全新的思路。
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| 文章作者：张先东等 中国动物检疫 文章编辑：一米优讯 |
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