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猪肌内脂肪沉积关键基因的表达分析
刘 娟，马艺珈，王 舒，路 畅，杨 阳，蔡春波，赵 燕，郭晓红，曹果清，李步高，高鹏飞*(山西农业大学动物科学学院，山西 太谷 030801)
摘 要：肌内脂肪含量及脂肪酸组成是影响猪肉品质的重要因素，本研究旨在从基因表达水平分析相关关键基因的表达特征。本研究以大白猪和马身猪为研究对象，采用qRT-PCR技术检测ATP5A1、NDUFAB1、CPOX、NDUFB7、NDUFV1和PSTPIP2在不同日龄以及不同组织中的表达规律，采用MEGA7.0软件进行物种进化树分析。结果显示，6个基因在不同日龄的马身猪和大白猪上均有表达，但随着日龄增长，基因的表达趋势不同。在马身猪中，ATP5A1、NDUFAB1、CPOX和NDUFB7的表达量均随着日龄增长逐渐降低，PSTPIP2表达量随着日龄增长出现先升高后降低的趋势，NDUFV1表达量随着日龄增长没有显著变化。在大白猪中，ATP5A1和 NDUFV1表达量随着日龄增长逐渐降低，NDUFAB1、CPOX和NDUFB7随着日龄增长出现先降低后升高的趋势，而PSTPIP2表达量随着日龄增长逐渐升高。组织表达谱发现，6个基因在脂肪的相对表达量极显著高于其他组织，另外，其在7种组织的相对表达量趋势不同。亲缘关系与进化树分析显示，6个基因在进化过程中比较保守。本研究结果可为进一步探讨猪肌肉脂肪酸代谢作用机制提供参考依据。
关键词：猪；肌内脂肪；脂肪酸；表达分析
随着生活和消费水平的提高，营养、绿色的肉品成为人们新的追求[1]。这对养殖业提出新的挑战，风味独特、瘦肉率高、脂肪含量低、嫩度高等成为肉质研究的主题。肌内脂肪是形成肉质风味的重要物质，其脂肪酸组成影响着肉类营养和感官品质指标[2]。单不饱和脂肪酸的氧化稳定性比多不饱和脂肪酸强，能使肉的口感和色泽更好[3]，而多不饱和脂肪酸可以降低人们患心血管疾病的风险[4]。因此，为了提高猪肉品质，研究出人们追求的绿色猪肉，了解脂肪酸代谢机制非常必要。
脂肪酸代谢机制一直是国内外科学家的研究热点。研究表明过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome Proliferators-activated Receptors γ，PPARγ)和核呼吸因子-1(Nuclear Respiratory Factor-1，NRF-1)或核呼吸因子-2(Nuclear Respiratory Factor-2，NRF-2)能够提高骨骼肌中脂肪酸引起的解偶联蛋白1 (Uncoupling Protein 1，UCP1)的转录[5]。研究发现长链酰基辅酶A合成酶1(Acyl-CoA Synthetase 1，ACSL1)作为线粒体内脂肪酸氧化代谢的关键酶，能分解棕色脂肪细胞中的甘油三酯，产生的脂肪酸在酰基辅酶A的作用下进入线粒体内氧化，激活细胞内的脂肪酸代谢，同时调节脂肪酸摄取[6]，增加油酸的摄入，提高不饱和脂肪酸的沉积量[7-8]。Lourdes等发现胰岛素生长因子2(Insulin Growth Factor 2，IGF2)在不同猪品种间存在g.3072G＞A突变，突变后该基因表达增加，导致多不饱和脂肪酸升高，单不饱和脂肪酸降低，从而影响脂肪酸组成[9]。Dragos等以硬脂酰辅酶A去饱和酶1 (Stearoyl-CoA Desaturase 1，SCD1)基因敲除小鼠为研究对象，分析SCD1在脂肪酸代谢过程中的作用，发现SCD1能够减少小鼠白色脂肪组织中脂肪酸再酯化，影响甘油生成和脂肪分解[10]。肝脏型肉毒碱棕榈酰转移酶1(Carnitine Palmitoyl Transferase 1，CPT1A)是长链脂肪酸β氧化的限速酶，可以催化长链脂肪酸从酰基辅酶A转化为酰基肉毒碱，使长链脂肪酸进入线粒体内氧化[11]，加速脂肪酸分解，减少体内脂肪含量[12]。
研究团队前期分析发现ATP5A1、NDUFAB1、CPOX、NDUFB7、NDUFV1和PSTPIP2在猪脂肪酸代谢中具有重要作用[13]。本研究以大白猪和马身猪为研究对象，利用qRT-PCR技术分析6个基因在猪肌肉发育过程中的表达变化及组织表达谱，基于这6个基因的氨基酸序列共同构建系统发育树，初步分析这6个基因在猪脂肪酸代谢过程中的表达规律和作用，为猪脂肪酸代谢的相关研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1样品采集
于1日龄、30日龄、60日龄、90日龄、120日龄、150日龄和180日龄分别随机选择3头体重相近的马身猪和大白猪，采集心、肝、脾、肾、脂肪、小肠、背最长肌和股二头肌，于液氮中保存备用。
1.1.2主要试剂
TRIzol Reagent (Life Technologies公司)；PrimeScriptTM RT reagent Κit with gDNA Eraser反转录试剂盒、SYBR Green RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)；乙醇、氯仿、异丙醇等均为国产分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1引物设计和合成
参考GenBank数据库中猪ATP5A1 (NM_001185142.1)、NDUFAB1 (NM_001167652.1)、CPOX(NM_001243844.1)、NDUFB7(XM_003480775.4)、NDUFV1 (XM_003122438.5)、PSTPIP2 (XM_021092533.1)和18S rRNA (NW_018085108.1)序列，其中18S rRNA为内参基因。使用Primer Premier 5.0设计引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列见表1。
1.2.2总RNA提取和cDNA合成
TRIzol Reagent提取总RNA后，用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，用核酸蛋白测定仪(ND-2000，Nanodrop，USA)测定总RNA的纯度和浓度。将得到的RNA通过反转录试剂盒反转录为cDNA，－20 ℃保存。
1.2.3 qRT-PCR检测基因表达
采用qRT-PCR检测6个基因表达，每个样本设3个重复，反应程序如下：预变性阶段，95 ℃ 30 s；循环阶段，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，45个循环；溶解阶段，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s。
1.2.4系统发育分析
在NCBI数据库(http：//plants.ensembl.org/index.html)获取9个物种(猪、山羊、牛、人、猕猴、鸡、绿头鸭、大鼠、小鼠)ATP5A1、NDUFAB1、CPOX、NDUFB7、NDUFV1和PSTPIP2的氨基酸序列。使用Clustal W 2.0 (http://www.clustal.org/clustal2/)[14]将6个基因的氨基酸序列进行比对。利用MEGA 7.0(https://www.megasoftware.net/)的邻接法构建系统进化树，使用Bootstrap法进行1 000次可信度检测。
1.2.5统计分析
运用SPSS 22.0软件进行基因表达差异分析，采用t检验分析基因在不同日龄间的表达差异，单因素方差分析基因在不同组织中的表达差异，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。
2 结果
2.1 基因在不同日龄的表达分析
在马身猪中，ATP5A1、NDUFAB1、CPOX和NDUFB7在1日龄表达量最高，90日龄表达量逐渐降低；NDUFV1和PSTPIP2在1日龄表达量最低，NDUFV1在180日龄表达量最高，PSTPIP2在120日龄表达量最高，180日龄有降低的趋势。在大白猪中，ATP5A1和 NDUFV1在1日龄时表达量最高，然后逐渐降低，180日龄表达量最低；NDUFAB1、CPOX和NDUFB7在1日龄表达量最高，90日龄表达量最低，180日龄表达量有升高趋势；PSTPIP2在1日龄表达量最低，随着日龄增长表达量逐渐升高，180日龄表达量最高。见图1。
两品种间比较发现，大白猪ATP5A1的表达量在30日龄和60日龄显著高于马身猪，在120日龄、150日龄和180日龄极显著低于马身猪；马身猪NDUFAB1的表达量在30日龄显著高于大白猪，在120日龄、150日龄和180日龄极显著低于大白猪；大白猪CPOX和NDUFB7的表达量在120日龄、150日龄和 180日龄极显著高于马身猪；NDUFV1的表达量在各个日龄(不包括90日龄)均有差异，大白猪在1日龄、30日龄和60日龄较高，马身猪在120日龄、150日龄和180日龄较高；大白猪PSTPIP2的表达量在60日龄、120日龄和180日龄显著高于马身猪，在150日龄极显著高于马身猪。
2.2 基因在不同组织的表达分析
6个基因在马身猪不同组织中均有表达，在脂肪中的表达量均极显著高于其他组织。ATP5A1、NDUFV1、NDUFAB1和NDUFB7在肝和脾中的表达量仅次于脂肪，接下来是小肠、肾和肌肉，在心脏中的表达量最低；CPOX在肌肉中的表达量仅次于脂肪，接下来是脾、心、小肠和肾，在肝中的表达量最低；PSTPIP2在肝、肾、心脏中的表达量极显著低于脂肪，脾脏中的表达量极显著低于肌肉。见图2。
2.3 猪与其他物种进化树的构建
将猪6个基因的氨基酸序列与其他物种比较发现(表2)，6个基因均较保守，猪与山羊、牛的同源性最高，为99.95％，与人的同源性为99.94％，与猕猴的同源性为99.93％，与鸡和绿头鸭的同源性最低，为99.8％。
根据6个基因氨基酸序列在不同物种之间的同源性比较结果构建进化树。如图3显示， 聚类数主要分为4个分支，其中山羊和牛组成反刍动物分支，再和猪聚在一起，人和猕猴组成灵长类分支，大鼠和小鼠组成啮齿类动物分支，最后鸡和绿头鸭组成禽类分支。禽类分支与其他分支距离最远。猪6个基因的氨基酸序列与牛和山羊的亲缘关系较近，其次是人和猕猴，亲缘关系最远的是绿头鸭和鸡。
3 讨论
肌内脂肪含量和脂肪酸组成可直接影响猪肉品质，尤其是肉的风味、嫩度、多汁性和营养价值。脂肪酸是肌内脂肪的物质前提，肉质是脂肪酸和肌内脂肪的体现。在脂肪酸中，饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸有较好的感官特性和工艺特性，主要影响肉质风味，而多不饱和脂肪酸具有较好的营养特性，影响肉质的营养价值[15]。油酸(C18∶1)是猪肉中含量最丰富的脂肪酸，可以作为改善猪肉感官和营养特性的重要指标[16]。
研究团队根据前期的转录组测序分析获得了一系列影响肌肉中脂肪酸代谢的基因，其中ATP5A1、NDUFAB1、CPOX、NDUFB7、NDUFV1和PSTPIP2在不同类型猪肌内脂肪中的表达量差异最显著[13]。ATP5A1是一种稳定的蛋白质，经常用作线粒体复合物的标记。线粒体中的二肽重复蛋白Poly(GR)通过泛素-蛋白酶体途径增加了ATP5A1的泛素化及其降解[17]。杨素丽等利用免疫组化方法检测发现大肠癌中的ATP5A1比相应癌旁组织的明显上调[18]。其他研究还验证了ATP5A1在肿瘤发病机制中起重要作用，可能通过调节肿瘤磷酸化与人类透明细胞肾细胞癌的发展相关联[19]。NDUFAB1作为线粒体代谢的新型增强剂，通过协同增强线粒体脂肪酸合成途径介导脂酰化和丙酮酸脱氢酶的活化，增加呼吸复合体和超复合体的组装，防止脂肪沉积过高而导致肥胖和胰岛素抵抗[20]。CPOX蛋白包含许多还原的硫醇残基，可催化血红素生物合成途径中的卟啉原-Ⅲ向原卟啉原-Ⅸ的两步脱羧反应，CPOX4缺失可导致血红素生物合成受损[21]。NDUFB7位于泛醌氧化还原酶复合物Ⅰ的膜间表面[22]，在线粒体活动供能方面起重要作用。NDUFV1和NDUFV2是涉及氧化应激和ATP产生的两个重要亚基[23]。有研究发现，NDUFV1可为母猪腹中胎儿发育提供能量[24]。PSTPIP2是一种与自身炎性疾病相关的蛋白，它参与巨噬细胞的活化、嗜中性粒细胞的运动和破骨细胞的分化等[25]。
Linn等对来自95个人的27个不同组织样本进行RNA测序发现，ATP5A1、NDUFAB1、CPOX、NDUFB7在心脏、肾、脂肪等组织中均有表达，其中ATP5A1、NDUFAB1在心脏中的表达量最高，CPOX在骨髓中的表达量最高，NDUFB7在脂肪中的表达量最高[26]。本研究中，ATP5A1、NDUFAB1、CPOX、NDUFB7在两个品种猪的不同日龄均有表达，且随着日龄增长表达量逐渐降低，在发育初期表达量较高。ATP5A1、NDUFAB1、CPOX、NDUFB7在脂肪中的相对表达量极显著高于其他组织，表明4个基因可能在猪发育初期的脂肪酸代谢过程中有重要作用，可为仔猪生长发育提供能量。Linn等发现，NDUFV1在人类25个组织中均有表达，在心脏中表达量最高[26]。本研究中，NDUFV1在脂肪中的相对表达量极显著高于其他组织，表明在猪的发育过程中NDUFV1能够促进脂肪沉积。PSTPIP2在人类17个组织中均有表达，其中在骨髓中的表达量最高[26]。本研究也发现PSTPIP2在脂肪中的相对表达量最高，提示PSTPIP2可能在猪的发育后期对脂肪沉积起作用。
本研究对影响猪肌内脂肪沉积与脂肪酸组成关键基因的表达特征进行分析，初步证明这些基因通过影响肌肉中脂肪酸的合成代谢可为机体提供能量，进而影响猪肉品质。本研究结果可为深入研究猪脂肪酸代谢机制提供理论依据，为探索猪脂肪酸对肉质性状影响提供参考。
参考文献：(26篇，略)
基金项目：山西省农业重点研发项目(201803D221022-1)；三晋(青年)学者(2016,2017)和山西省“1331工程”技术研究中心建设项目资助作者简介：刘娟(1995— )，女，硕士，研究方向为动物遗传资源评价与利用；E-mail：1834176602@qq.com*通信作者：高鹏飞(1980— )，男，教授，研究方向为动物遗传资源评价与利用；E-mail：gpf800411@126.com
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