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猪精不同冻融方法效果对比
周健1，曹婷婷1，2，曹俊新1，赵云翔1，2*
（1.广西贵港秀博基因科技股份有限公司，广西 贵港 537100；2.佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东 佛山 528000）
随着养猪业的不断发展，人工授精技术在养猪业中不断推广和应用，很大程度上提升了生产效率和公猪利用率，增加了养殖效益。猪精液冷冻保存技术可以解决猪精不能长期保存的困扰，目前公猪精液冷冻技术国内外均有研究，虽然均取得了一定突破，但操作难度大、且在受胎率、产仔数方面都低于鲜精，这也是制约冻精推广的主要因素。
目前猪精冷冻方式主要分为程序冷冻和熏蒸冷冻两种，本研究通过比较两种冷冻方式对猪精的冷冻效果，以期待在保证冷冻效果的前提下利用程序冷冻仪代替传统熏蒸冷冻，来进行大规模公猪冻精批量化生产；当前猪冻精规格多数采用0.5mL/支，虽然小规格有利于冻精生产和复苏，但在猪场实际应用较为不方便，尤其是单支解冻不利于猪场实际配种操作，目前尚未见到批量解冻冻精的报道，所以本文批量解冻实验希望能够提高冻精实际应用效率，以便更有利于冻精的推广应用。
材料与方法
试验选用沈阳秀博种猪繁育科技有限公司成年纯种公猪24头，体质健壮，性欲旺盛。原精要求：精子活力≥90%，精子密度≥2亿/mL，精子畸形率≤10%。
配制冷冻保护液。
首先在1000mL的烧杯中准确倒入770mL超纯水，在磁力搅拌器上搅拌并加热至34℃，此时缓缓倒入基础稀释粉，充分搅拌溶解，待溶液pH稳定后加200mL新鲜卵黄并充分搅拌溶解，取出500mL作为冷却液；向剩余溶液中添加30mL甘油和5g乳化剂Equex-Paste，充分搅拌溶解后作为冷冻液。
本实验主要采用熏蒸冷冻和程序冷冻来进行冻精实验。
熏蒸冷冻条件为液氮面距离冻精细管横截面中心3cm，密闭熏蒸8min；程序冷冻采用表1的冷冻曲线进行操作。检测合格的原精使用常温保存稀释液进行1～2倍等温稀释，梯度降温至17℃，在此温度下900g离心20min，抽弃上清液后添加冷却液，充分悬浮后放置5℃平衡柜中平衡3h，待精液温度降至5℃后添加冷冻液，调整精液浓度为8亿/mL，充分悬浮后进行灌装，之后分别进行熏蒸冷冻和程序冷冻。
本实验采用50℃水浴16s进行解冻，批量解冻实验共分为9个实验组，使用自制的批量解冻器依次解冻9个实验组冻精，每次解冻后需擦干批量解冻器，方可进行下一批次解冻，不可留有水滴，若有水滴会影响解冻效果。解冻后使用精液分析仪（IVOS-II）检测精子活力和前向精子。
数据先使用Excel处理，再使用SAS9.2软件进行单因素方差检验，结果以“平均值±标准差“表示，P＜0.05表示差异显著。
结果与分析
不同冷冻方法对冻精活力和前向精子的影响，详见表2。
由表2可知，熏蒸冷冻组解冻后精子活力（65.961±7.733）与程序冷冻组（70.100±8.755）差异不显著（P＞0.05）；解冻后前向精子占比两组之间也没有显著差异（P＞0.05），但程序冷冻组在数值上偏高。
批量解冻不同数量冻精细管，精子活力和前向精子结果如表3。
由表3可知，解冻后精子活力方面，T3组精子活力（70.038±14.458）显著高于T9组（57.485±9.321）（P＜0.05），但是T3组和T9组分别与其余各组在解冻后精子活力上差异不显著（P＞0.05）；解冻后前向精子方面，T1组（36.062±11.326）、T3组（38.308±11.547）、T5组（36.600±10.204）均显著高于T9组（23.738±7.689）（P＜0.05），但与其余组之间均没有显著差异（P＞0.05），T9组与T2、T4、T6、T7、T8组之间差异不显著（P＞0.05）。
熏蒸冷冻与程序冷冻对复苏后
精子活力和前向精子的影响
目前国内外精液冷冻主要采取两种方法，即熏蒸法和程序冷冻法，两种方法在不同动物上均已广泛使用。众所周知，精子在冷冻过程中面临着冰晶、渗透压及活性氧（ROS）的威胁，以一定的降温速率来冷冻精子，使其安全通过危险区对精子冷冻至关重要。研究表明，冷冻过程中水分子玻璃化状态下最有利于精子保存，对精子的理化损伤最小。熏蒸法冷冻虽然也取得了一些良好的冷冻效果，但由于其客观因素影响较大，其对降温速率主观干预性较差，而程序冷冻可以做到对冷冻曲线实时监控，人为主观调控力强，使实际降温速率最大限度地按照设定的速率进行，保证降温速率稳定进行，理论上可以增加不同批次间冷冻效果的稳定性。虽然实验1复苏后的精子活力和前向精子占比在统计学上无显著差异，但在数值上程序冷冻要优于熏蒸冷冻，目前很多学者都进行过精液不同方法的冷冻研究。
批量解冻与单支解冻对复苏后
精子活力和前向精子的影响
众所周知，冻精解冻过程中的冷冻损伤是不可避免的，如何更好地优化解冻程序，增加解冻后精子的存活率是目前冻精应用研究的方向之一。根据猪场实际需求，方便猪冻精在人工授精中的操作性，提高使用效率，特进行了0.5mL冻精的批量解冻实验，根据实验结果，同时解冻8支0.5mL公猪冻精与单支解冻后在精子活力和前向精子占比上均没有显著差异（P＞0.05）；当同时解冻9支时，解冻后精子活力和前向精子占比显著低于单支解冻（P＜0.05），其原因可能是由于放入水浴中的冷源过多，超过最佳升温速率的上限，无法快速通过-30℃～70℃危险区，造成精子损伤比例偏大所致。据相关报道，精子的冻融弹性因其品种品系、精子大小形状及脂质含量等特性而有所不同，所以导致冷冻和解冻程序也不尽相同。研究人员在众多物种上都在进行冷冻子的研究，解冻的程序也不尽相同，本次0.5mL批量解冻实验可以为优化公猪冻精推广使用方案提供一定的数据支持，有利于当前环境下优秀公猪基因的传播。
结论
结论1：使用熏蒸冷冻（距液氮面3cm，熏蒸8min）和程序冷冻（使用本文降温曲线进行冷冻）公猪精液在解冻后精子活力和前向精子占比两个指标上没有显著差异。
结论2：50℃ 16s水浴一次性批量解冻8支以内（含8支）0.5mL冻精细管，解冻后精子活力和前向精子占比与单支解冻均没有显著差异，本实验对猪冻精解冻方法的研究，可为优化冻精在猪场应用提供一定的数据支撑。
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