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摘要：为了解上海市猪丹毒杆菌流行株的耐药状况，对上海市2011—2017年分离到的猪丹毒杆菌采用纸片扩散法（K-B法）和微量肉汤稀释法（MIC法）进行药敏试验，同时对临床分离株与健康带毒株的MIC结果进行比较。结果显示：所有菌株对β-内酰胺类和大环内酯类药物敏感，而对林可霉素、四环素类、氯霉素类、喹诺酮类等原本敏感的药物，已产生较强耐药性；对临床分离株与健康带毒株的MIC结果比较分析发现，致病菌株和健康带毒株的耐药性存在较大差异。结果表明，上海市猪丹毒杆菌耐药情况较为严峻，除对β-内酰胺类和大环内酯类药物较为敏感外，对其他药物均出现不同程度的耐药。本研究为临床合理用药提供了有价值的参考资料。
猪丹毒（swine erysipelas）是由猪丹毒杆菌（Erysipelothrix rhuiopathiae）感染引起的一种急性热性传染性疾病。感染猪可发生心内膜炎和关节炎，严重者出现败血症，给养猪业造成了严重经济损失。同时，它还是一种人兽共患病，不仅可以感染人表层皮肤，还可以造成菌血症和心内膜炎。该病分布于世界各地，主要感染3~12月龄猪，一年四季均可发病，以炎热多雨季节为盛；常为散发性，偶有暴发性流行，发病率一般为10%~15%，严重时死亡率可达50%。在20世纪90年代初期，我国通过疫苗免疫等防控手段，使猪丹毒得到了有效控制。但近年来，猪丹毒“老病新发”。自2010年开始，我国多个省份出现了猪丹毒较大范围流行，如江苏、湖南、福建、云南、广东等地均有该病暴发的报道，给我国养猪业带来了严重危害。2010年以来，上海市动物疫病预防控制中心确诊的猪丹毒病例不断增加，2014年达到高峰，发病率约为30%，死亡率高达80%，体质量75 kg以上的育肥猪及母猪易发病。鉴于此，本研究拟通过对不同来源猪丹毒菌株的耐药性进行分析比较，了解临床分离的致病菌株与屠宰场分离的健康带毒株的耐药现状及差异，以期为上海市猪丹毒防控及临床合理用药提供参考。
材料与方法
菌株
参考菌株 猪丹毒杆菌G4T10株，分离自中牧实业股份有限公司生产的猪瘟、猪丹毒和猪多杀性巴氏杆菌病三联活疫苗。
临床分离株 2011—2015年分离自上海市猪丹毒发病率较高猪场病死猪的脏器，包括心、肝、脾、肺、肾，共计41株。
健康带毒株 2016—2017年分离自上海市屠宰场正常屠宰猪的脏器，包括扁桃体、淋巴结和肺脏，共计37株。
试剂
临床常用的18种药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司。其中用于Kirby-Baued纸片琼脂扩散法（K-B法）试验的药物为四环素、强力霉素、林可霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、磺胺异噁唑、复方新诺明、红霉素、阿奇霉素、恩诺沙星、氧氟沙星、头孢拉定、头孢曲松、阿莫西林、阿莫西林/棒酸、氨苄西林；用于微量肉汤稀释法（MIC法）的药物为青霉素、氨苄西林、头孢噻呋、泰乐菌素、替考米星、托拉菌素、克林霉素、泰妙菌素、恩诺沙星、达氟沙星、金霉素、土霉素、庆大霉素、氟苯尼考、大观霉素、新霉素、磺胺间二甲氧嘧啶、复方新诺明。MIC药敏板（型号BOP06F牛/猪类药敏板），购自ThermoFisher Scientific公司；TSA平板培养基，购自美国BD公司。
操作步骤
K-B法 将41株临床分离株分别涂布于TSA平板，待稍干后用无菌镊子将18种药敏纸片分别平贴于培养基表面，置于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养24 h，观察测定抑菌圈大小。根据杭州天和微生物试剂有限公司提供的K-B法药敏试验抑菌圈直径标准判定结果。
MIC法 以G4T10株为参考菌株，41株临床分离株与37株健康带毒株为试验菌株。采用美国临床验证标准委员会（CLSI）推荐的方法：在MIC药敏板中连续倍比稀释药物，得到一系列100 μL药物梯度稀释液，空白对照为培养基（100 μL），阴性对照为菌悬液和培养基的混合物（100 μL）；将MIC药敏板置于37 ℃培养箱中培养24 h，根据CLSI抗生素的判定标准（M45-A2）进行结果判定（同时参照同属链球菌的判定标准进行结果判定）。
结果与分析
K-B法
41株临床分离株的敏感药物主要为β-内酰胺类（敏感率分别为阿莫西林100%、阿莫西林/棒酸94.74%、氨苄西林84.21%）和大环内酯类（敏感率分别为红霉素84.21%、阿奇霉素84.21%）。临床分离株对多种抗菌药物的敏感率较低，包括四环素类（敏感率分别为四环素21.05%、强力霉素10.00%）、头孢菌素类（敏感率分别为头孢拉定31.58%、头孢曲松47.36%）、喹诺酮类（敏感率分别为恩诺沙星11.11%、氧氟沙星32.46%）、林可霉素（敏感率11.11%），对氯霉素、磺胺类（磺胺异噁唑、复方新诺明）和氨基糖苷类（庆大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素）药物敏感率均为0，即完全耐药。详见图1。
MIC法
所有菌株的敏感药物为β-内酰胺类和大环内酯类药物，对其他抗菌药物均表现不同程度耐药。其中耐药程度较高的为四环素类（耐药率分别为金霉素98.72%、土霉素96.15%）、氨基糖苷类（庆大霉素耐药率为98.72%）、氯霉素类（氟苯尼考耐药率为76.93%）、喹诺酮类（恩诺沙星耐药率为65.38%），详见表1。
临床分离株与健康带毒株MIC试验结果比较发现，临床分离株的耐药程度总体要高于健康带毒株，其中对达氟沙星、恩诺沙星、大观霉素、泰妙菌素等药物的耐药性差异较大。由图2可知，90%以上的临床分离株对达氟沙星、恩诺沙星耐药，80%左右的临床分离株对大观霉素、泰妙菌素耐药，而健康带毒株中只有20%左右对上述药物耐药。
讨论
自1882年Pasteur和Thuillier在死猪体内分离到猪丹毒杆菌后，人们逐渐对该杆菌有了认识。发病猪临床表现形式大致可分为3种类型，即急性、亚急性和慢性型。急性型主要表现为明显的败血性症状，亚急性型则是病猪皮肤出现疹块，慢性型则以出现关节炎和心内膜炎为主要特征。疫苗免疫接种被认为是防控猪丹毒最经济、有效的手段。但是传统灭活苗、弱毒苗或多联苗存在一定缺陷，如病猪、瘦弱猪、食欲或体温不正常猪以及临产期母猪，均不宜注射疫苗，并且由于个体差异，抗体产生时间和水平也不同。弱毒株接种猪只后有可能恢复毒力，或者隐性感染猪接种疫苗后，可能会引发弱毒苗菌株毒力返强而导致猪发病，同时流行菌株之间的差异也会在一定程度上导致免疫失败。所以防治猪丹毒，除做好免疫接种外，还应结合使用抗生素，即在限抗政策允许范围内，合理科学使用抗生素。
本研究采用K-B法对上海市2011—2015年猪丹毒杆菌临床分离株进行了药敏试验。结果显示，猪丹毒杆菌对β-内酰胺类和大环内酯类药物敏感，对磺胺类和氨基糖苷类则全部耐药，这与2020年龚争等报道的华东地区猪丹毒杆菌分离株耐药性分析结果一致。虽然青霉素类药物仍然是防治猪丹毒的首选药物，但本试验显示临床分离株对头孢曲松、头孢拉定等头孢菌素类药物的敏感性较低，并且对四环素类（四环素、强力霉素）、林可霉素、氯霉素及喹诺酮类（恩诺沙星、氧氟沙星）等药物的耐药性明显增强。据报道，Ding等对2012—2013年在我国7个省收集的48株猪丹毒杆菌进行耐药性分析，姚炎彬等对2012—2015年安徽省猪丹毒杆菌分离株进行耐药性分析，其结果均显示猪丹毒杆菌的耐药性明显小于本次试验的分析结果。推测原因，一是头孢菌素类抗生素具有抗菌谱广、抗菌作用强、使用安全等众多优势，使得其在兽医临床中被广泛使用，但同时不合理使用导致临床细菌对头孢菌素的耐药性也大大增加；二是抗生素选择性压力导致耐药菌株增殖。因此在使用抗菌药物过程中，必须加强抗菌药物敏感性的实时监测，掌控猪丹毒杆菌耐药性的变化趋势，从而筛选合适药物应用于临床。这不仅有利于减缓猪丹毒杆菌耐药性产生的速度，更对猪丹毒防控有重要意义。
为验证K-B法对猪丹毒杆菌敏感性试验的有效性及准确性，本研究又采用MIC法对上海市78株猪丹毒杆菌分离株进行药敏试验。结果显示，猪丹毒杆菌对β-内酰胺类和大环内酯类药物敏感，这与K-B法结果一致。同时本研究还对临床分离的致病菌株和屠宰场分离的健康带毒株的MIC结果进行了比较分析。结果显示，临床分离的致病菌株耐药程度整体高于屠宰场分离的健康带毒株，其中对达氟沙星、恩诺沙星、大观霉素、泰妙菌素的耐药性差异较大。而达氟沙星和恩诺沙星属于喹诺酮类，大观霉素属于氨基糖苷类，泰妙菌素属于双萜类。目前，我国批准的动物养殖业可用于防治动物疾病和促生长的兽用抗菌药分为抗生素和合成抗菌药两大类，其中就包括氨基糖苷类、喹诺酮类药物。2015年李敬涛等对湖北省某猪场病死猪中分离的猪丹毒杆菌进行药敏试验，发现临床分离菌株的耐药性比较严重且耐药谱广。究其原因可能是养殖户在养殖和疾病防控中大量使用相关抗生素，从而加速了耐药性的产生。
本试验虽然对2011—2017年上海市猪丹毒杆菌分离株的耐药性进行了分析，但是分离菌株并未表现出规律性的耐药性变迁。针对目前上海市猪丹毒杆菌耐药性的变化，应该引起广泛重视。在临床治疗猪丹毒时，应结合药敏试验结果科学合理用药，同时注意给药次数及时间，避免反复用药，以避免增加猪丹毒杆菌的耐药性。
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