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非洲猪瘟病毒I177L基因缺失毒株鉴别检测规范


现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2022/6/28 8:03:33 关注:208 评论: 我要投稿

非洲猪瘟病毒I177L基因缺失毒株鉴别检测规范


本规范适用于非洲猪瘟病毒I177L基因缺失毒株的荧光PCR检测。

1 主要试剂

1.1 病毒DNA提取试剂盒。

1.2 无核酸酶的水。

1.3 探针法荧光PCR预混液。

1.4 引物和探针:P72和I177L基因扩增引物和探针,均由国家非洲猪瘟参考实验室设计、提供。

1.5 阳性和阴性对照:每次荧光PCR检测,应加阳性对照、阴性对照。阳性对照为ASFV基因组DNA标准物质。阴性对照用水替代样品DNA。

2 主要仪器设备

2.1 荧光PCR仪。

2.2 台式低温高速离心机。

2.3 组织匀浆仪。

2.4 全自动核酸提取仪。

2.5 微量可调移液器。

2.6 无核酸酶的离心管、PCR管和吸头。

3 样品采集和运输保存

在活体检查时,可采集猪的抗凝全血(EDTA抗凝)、口鼻拭子或者血清等;病死猪可采集脾脏、淋巴结、扁桃体、肝脏等组织病料。尽快送至实验室进行病毒核酸检测。

样品的采集、运送与保存应满足NY/T 541《兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范》的相关要求。样品可在4℃最长保存2天,长时间保存应在-20℃以下冷冻保存。

4 样品处理

4.1 组织样品

取0.1g-0.2g组织样品切成小碎块,加入lmL-2mL预冷的PBS缓冲液(pH7.4)用组织匀浆仪高速匀浆,制成10%组织匀浆液,5000r/min离心10min,取200μL清液进行核酸提取。

4.2 液体样品

抗凝全血、血清等液体样品,直接取200μL提取核酸。

5 病毒核酸提取

采用病毒DNA提取试剂盒或自动化核酸提取仪提取病毒核酸。提取后的核酸溶液应立即使用或置于-20℃以下冷冻保存(6个月内使用)。

6 荧光PCR检测

6.1 荧光PCR反应液制备

在无核酸酶的离心管中制备荧光PCR反应混合液,组成

包括:P72基因和I177L基因探针预混液、2×探针法荧光PCR预混液和无核酸酶的水。反应体系配制见下表。

表1 每个反应体系配置

试剂名称

体积(μL)

2×探针法荧光PCR预混液

12.5

P72基因和I177L基因探针预混液

2

无核酸酶的水

5.5

模板

5

总计

25

6.2 荧光PCR扩增条件

50℃2分钟;95℃5分钟;95℃15秒,60℃1分钟,40个循环,在每一循环的60℃时收集FAM和VIC荧光信号。

6.3 结果分析

Ct值由荧光PCR仪软件自动确定。

6.3.1试验成立条件

阳性对照中P72和I177L基因的Ct值均应<35且出现特异性扩增曲线,阴性对照的P72和I177L基因均应无Ct值或Ct值≥40且无特异性扩增曲线。同时满足上述条件时试验结果有效,否则应重新进行试验。

6.3.2 检测结果判定

FAM通道对应P72基因,VIC通道对应I177L基因。被检样品Ct值≤38且出现特异性扩增曲线时,判为目标基因阳性;无Ct值或Ct值≥40时,判为目标基因阴性;38

6.3.3 综合判定

最终判定应结合P72和I177L两个基因的检测结果进行综合分析,具体判定标准见表2。

表2 综合判定标准

综合判定结果

检测结果

P72-FAM

I177L-VIC

ASFV阳性

+

+

ASFV I177L基因缺失毒株阳性

+

-

ASFV阴性

-

-

注: “+”代表阳性;“-”代表阴性。


文章来源:山西省农业农村厅     文章编辑:一米优讯     
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