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非洲猪瘟病毒I177L基因缺失毒株鉴别检测规范
本规范适用于非洲猪瘟病毒I177L基因缺失毒株的荧光PCR检测。
1 主要试剂
1.1 病毒DNA提取试剂盒。
1.2 无核酸酶的水。
1.3 探针法荧光PCR预混液。
1.4 引物和探针:P72和I177L基因扩增引物和探针，均由国家非洲猪瘟参考实验室设计、提供。
1.5 阳性和阴性对照:每次荧光PCR检测，应加阳性对照、阴性对照。阳性对照为ASFV基因组DNA标准物质。阴性对照用水替代样品DNA。
2 主要仪器设备
2.1 荧光PCR仪。
2.2 台式低温高速离心机。
2.3 组织匀浆仪。
2.4 全自动核酸提取仪。
2.5 微量可调移液器。
2.6 无核酸酶的离心管、PCR管和吸头。
3 样品采集和运输保存
在活体检查时，可采集猪的抗凝全血(EDTA抗凝)、口鼻拭子或者血清等；病死猪可采集脾脏、淋巴结、扁桃体、肝脏等组织病料。尽快送至实验室进行病毒核酸检测。
样品的采集、运送与保存应满足NY/T 541《兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范》的相关要求。样品可在4℃最长保存2天，长时间保存应在-20℃以下冷冻保存。
4 样品处理
4.1 组织样品
取0.1g-0.2g组织样品切成小碎块，加入lmL-2mL预冷的PBS缓冲液(pH7.4)用组织匀浆仪高速匀浆，制成10%组织匀浆液，5000r/min离心10min，取200μL清液进行核酸提取。
4.2 液体样品
抗凝全血、血清等液体样品,直接取200μL提取核酸。
5 病毒核酸提取
采用病毒DNA提取试剂盒或自动化核酸提取仪提取病毒核酸。提取后的核酸溶液应立即使用或置于-20℃以下冷冻保存(6个月内使用)。
6 荧光PCR检测
6.1 荧光PCR反应液制备
在无核酸酶的离心管中制备荧光PCR反应混合液，组成
包括：P72基因和I177L基因探针预混液、2×探针法荧光PCR预混液和无核酸酶的水。反应体系配制见下表。
表1 每个反应体系配置
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试剂名称
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体积(μL)
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2×探针法荧光PCR预混液
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12.5
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P72基因和I177L基因探针预混液
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2
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无核酸酶的水
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5.5
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模板
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5
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总计
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25
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6.2 荧光PCR扩增条件
50℃2分钟；95℃5分钟；95℃15秒，60℃1分钟，40个循环，在每一循环的60℃时收集FAM和VIC荧光信号。
6.3 结果分析
Ct值由荧光PCR仪软件自动确定。
6.3.1试验成立条件
阳性对照中P72和I177L基因的Ct值均应<35且出现特异性扩增曲线，阴性对照的P72和I177L基因均应无Ct值或Ct值≥40且无特异性扩增曲线。同时满足上述条件时试验结果有效，否则应重新进行试验。
6.3.2 检测结果判定
FAM通道对应P72基因，VIC通道对应I177L基因。被检样品Ct值≤38且出现特异性扩增曲线时，判为目标基因阳性；无Ct值或Ct值≥40时，判为目标基因阴性；38
6.3.3 综合判定
最终判定应结合P72和I177L两个基因的检测结果进行综合分析,具体判定标准见表2。
表2 综合判定标准
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综合判定结果
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检测结果
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P72-FAM
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I177L-VIC
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ASFV阳性
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+
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+
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ASFV I177L基因缺失毒株阳性
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+
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-
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ASFV阴性
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-
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-
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注: “+”代表阳性；“-”代表阴性。
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