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摘要：为了解新疆和田地区鹅源沙门氏菌流行血清型及其耐药性，无菌采集和田地区两个鹅场（A场和B场）病死鹅内脏、肛拭子样本，用常规方法进行沙门氏菌分离鉴定，利用PCR进行验证和血清型鉴定，用K-B法进行分离株耐药性检测。结果显示：共分离出14株沙门氏菌，总分离率为1.81%（14/773）。A场死亡鹅内脏样本的沙门氏菌分离率为1.33%（4/300），肛拭子样本分离率为1.66%（5/300），在存活病鹅肛拭子中未分离出沙门氏菌（0/25）；B场死亡鹅内脏样本的沙门氏菌分离率为20.00%（4/20），肛拭子样本中未分离到沙门氏菌（0/19），存活病鹅肛拭子样本分离率为0.91%（1/109）。共分离出4种血清型，占比分别为鼠伤寒沙门氏菌42.86%（6/14）、肠炎沙门氏菌21.43%（3/14）、德比沙门氏菌7.14%（1/14）、纽兰沙门氏菌7.14%（1/14）。沙门氏菌分离株对多黏菌素B、哌拉西林-他唑巴坦、阿莫西林-棒酸和头孢吡肟较为敏感，对其余10种抗菌药物具有一定耐药性，其中对氨苄西林和链霉素耐药性极强。结果表明，和田地区鹅源沙门氏菌血清型复杂，其中鼠伤寒沙门氏菌为优势血清型，不同养殖场流行的血清型种类及优势血清型有差异；流行的鹅源沙门氏菌耐药较为普遍，且表现为多重耐药。结果提示，各养殖场应根据流行的具体血清型沙门氏菌株，科学合理使用临床抗菌药物。沙门氏菌血清型繁多，分布广泛，是重要的人兽共患病的病原体，可引起动物的肠炎、菌血症和肠外感染等急性或慢性疾病，严重时还会导致患病动物死亡。沙门氏菌可以导致2~3周龄的雏鹅大批死亡，致死率可达15%以上，严重时可达80%。沙门氏菌不仅对幼鹅有重大危害，还会对鹅蛋的孵化造成严重影响，可经种鹅生殖道垂直传播至鹅蛋中，导致许多雏鹅在孵化过程中就感染死亡，而携带沙门氏菌的鹅胚即使在孵化过程中存活，也会在出壳后几天内死去，成活率极低。沙门氏菌抗原由菌体抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（荚膜或包膜抗原）组成，依据这3种抗原的组成不同，可将沙门氏菌分为不同的血清型。截至2018年，沙门氏菌已被确认有血清型2 610种。在沙门氏菌血清型中，鼠伤寒沙门氏菌致病性较强，禽类感染后的发病率及死亡率最高。在全球范围内，最常见的血清型是肠炎沙门氏菌，其次为鼠伤寒沙门氏菌。在发达国家中，流行的血清型以鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌这两种血清型为主。对英格兰和威尔士的禽类进行沙门氏菌感染情况调查发现，鼠伤寒沙门氏菌感染率在禽类中位居第一，其次是鸡白痢伤寒和肠炎沙门氏菌。我国2006—2012年分离的323株禽源沙门氏菌以鸡白痢、鼠伤寒和肠炎沙门氏菌为主要流行血清型，其中在鹅源沙门氏菌中占比较高的依次为鼠伤寒（11/66）、肠炎（10/66）、印第安纳（10/66）和波茨坦（10/66）血清型。2010—2015年调查发现，新疆地区也以肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌为主要血清型。2018年以来，新疆和田地区养鹅业发展迅速，但雏鹅的成活率一直非常低，初步怀疑是沙门氏菌导致的。目前关于新疆和田地区鹅源沙门氏菌的报道极少，因而该地区鹅源沙门氏菌流行血清型及其耐药情况并不十分清楚。为了解新疆和田地区鹅源沙门氏菌血清型的分布特点及其耐药性，采集两个规模化养鹅场的病死鹅样本进行沙门氏菌分离、血清型鉴定和耐药性分析，以期为和田地区鹅沙门氏菌病防控以及指导临床科学用药提供参考。
材料与方法
材料样品 2021年4月，于新疆和田地区两个规模化养殖鹅场，无菌采集不同日龄病死鹅内脏及肛拭子样本，放置于含有缓冲蛋白胨水（BPW）肉汤的4 mL EP管中，37 ℃培养箱中培养12~16 h。主要试剂及仪器 BPW、RVS肉汤、HE（Hektoen Enteric）琼脂、SS琼脂、TTB培养基，均购自青岛海博生物科技有限公司；XLT4琼脂和配套试剂27%十四烷基磺酸钠溶液，购自北京陆桥技术股份有限公司；沙门氏菌显色培养基，购于广东环凯微生物科技有限公司；革兰氏染色剂，购自珠海贝索生物技术有限公司；PCR反应相关试剂（2×Taq PCR Green Mix、ddH2O），购自北京全式金生物技术有限公司。TS-2102C恒温摇床，购自上海天呈实验仪器制造有限公司；SW-CJ-2F双人双面垂直洁净工作台，购自上海博讯实业有限公司；GSX1梯度PCR扩增仪，购自美国Eppendorf公司；DYY-6C电泳仪，购自北京市六一仪器厂；DYY-7C型电泳仪，购自北京市六一仪器厂；凝胶成像系统，购自美国Bio-Rad公司；高温高压灭菌锅，型号HVE-50。引物合成 参照相关文献设计沙门氏菌invA靶基因引物、多重血清型引物以及鼠伤寒型（TMP1、TMP2、TMP3）、霍乱型（CMP1、CMP2、CMP3）、婴儿型（IMP1、IMP2、IMP3）、哈达尔型（HMP1、HMP2、HMP3）、肠炎型（EMP1、EMP2、EMP3）、都柏林型（DMP1、DMP2、DMP3）和鸡伤寒型（GMP1、GMP2、GMP3）引物，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列信息详见表1。
药敏片 18种药敏片，购自杭州滨和微生物试剂有限责任公司，详细信息见表2。
方法样品处理及细菌培养 参照GB 47894—2016沙门氏菌检测方法，从预增菌的BPW中吸取300 μL菌液接种于3 mL RVS增菌液中，42 ℃恒温摇床120 r/min培养24 h；将RVS培养物平板划线接种HE和SS琼脂平板，37 ℃培养24 h。分离菌株生化试验 在HE、SS琼脂平板上，挑选每个样本区域中疑似沙门氏菌的单菌落置于RVS肉汤中培养24 h，然后取20 μL菌液接种于沙门氏菌成套生化鉴定管中，再挑取样本对应的单菌落穿刺于卫矛醇半固体中，37 ℃培养24~48 h，观察并记录试验结果。沙门氏菌PCR鉴定 采用水煮法提取菌落DNA。挑取符合沙门氏菌生化鉴定结果的RVS肉汤，将1 mL菌液置于1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心3 min，弃上清液；加入1 mL无菌缓冲液，混匀，12 000 r/min离心3 min，弃上清液（重复2次）；加入200 µL无菌Buffer混匀后放入100 ℃的水浴中，12 000 r/min，离心1 min，收集并保存上清液作为PCR模板。以疑似沙门氏菌的DNA为模板，利用PCR法扩增沙门氏菌特异性invA基因；以沙门氏菌XJ-e7菌株作为标准阳性对照，空白肉汤为阴性对照，检测DNA样本中是否携带invA目的基因片段。PCR总反应体系为12.5 μL。PCR运行参数：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。将PCR扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶中电泳，通过凝胶成像分析系统观察并记录结果。血清学检测 采用相关文献报道的方法，对7种临床常见沙门氏菌血清型进行鉴别，参照该文献中的PCR反应体系，扩增沙门氏菌阳性样本。反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，35个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。将扩增产物在2.5%琼脂糖凝胶中电泳2 h，通过凝胶成像分析系统观察并记录结果。耐药性检测 采用CLSI推荐的K-B法，对分离到的沙门氏菌菌株进行常规的18种抗菌药物敏感性检测。挑取纯化的单菌落2~3个，接种于MH肉汤中，37 ℃摇床培养12 h；调整菌悬液至0.5麦氏浊度，用灭菌棉签蘸取菌悬液，均匀且紧密地涂布在MH平板上，室温下放置5 min，药敏片接触平板后不得移动；将MH平板置于37 ℃的培养箱中培养18 h后，用标尺测量并记录抑菌圈直径，根据CLSI（2016年版）标准，评价敏感（S）、中介（I）和耐药（R）。对3种及以上抗菌药物同时耐药的菌株被确定为多重耐药菌。
结果
沙门氏菌分离鉴定培养基分离结果（图1）、生化鉴定结果（图2）和PCR验证结果（图3）显示，在两个鹅场样本中共分离到14株沙门氏菌，分离率为1.81%（14/773）。A场：死亡鹅内脏样品的沙门氏菌分离率为1.33%（4/300），肛拭子的沙门氏菌分离率为1.66%（5/300），存活病鹅肛拭子中未分离出沙门氏菌，鹅样本中的沙门氏菌总分离率为1.44%（9/625）。B场：病死鹅内脏样品的沙门氏菌分离率为20.00%（4/20），肛拭子中未分离出沙门氏菌，存活病鹅肛拭子中的沙门氏菌分离率为0.91%（1/109），鹅样本中的沙门氏菌总分离率为3.37%（5/148）。
沙门氏菌血清型以分离到的14株沙门氏菌DNA为模版，经PCR检测和16S rRNA基因序列分析比对，鉴定其血清型。结果（图4~5）显示：有11株沙门氏菌血清型鉴定成功，共包含4种血清型，其中鼠伤寒沙门氏菌占42.86%（6/14），肠炎沙门氏菌占21.43%（3/14），德比沙门氏菌（登录号YSJHNRTA016）占7.14%（1/14），纽兰沙门氏菌（登录号YSJSGXWF013）占7.14%（1/14）；剩余3株沙门氏菌，经上述方法未能鉴定成功，无法辨别其血清型。在分离到的14株沙门氏菌中，A场鼠伤寒沙门氏菌占11.1%（1/9），肠炎沙门氏菌占33.3%（3/9），德比沙门氏菌占11.1%（1/9），纽兰沙门氏菌占11.1%（1/9）；B场沙门氏菌血清型均为鼠伤寒沙门氏菌（5/5）。
沙门氏菌耐药性选取10株沙门氏菌分离株进行耐药性检测发现，10株沙门氏菌均表现为对3种及以上抗菌药物同时耐药（图6），且全部对氨苄西林和链霉素耐药。耐药种数为13~15种的沙门氏菌有5株，占比为50%（5/10）；对10种抗菌药物同时耐药的有2株，占比为20%（2/10）；对3种抗菌药物同时耐药的有1株，占比为10%（1/10）；对4种抗菌药物同时耐药的有2株，占比为20%。
沙门氏菌分离株对18种药物呈现不同的耐药性（图7），其中对多黏菌素B和哌拉西林-他唑巴坦的耐药率为10%，对阿莫西林-棒酸和头孢吡肟的耐药率均为20%，对头孢他啶的耐药率为40%，对氨苄西林-舒巴坦的耐药率为50%，对头孢噻肟、氨曲南、庆大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、环丙沙星、四环素、磺胺甲基异恶唑和氯霉素的耐药率为60%~70%，对氨苄西林和链霉素的耐药率均为100%。结果表明，沙门氏菌分离株对多黏菌素B、哌拉西林-他唑巴坦、阿莫西林-棒酸和头孢吡肟这4种抗菌药物较为敏感，而对其他10种抗菌药物均表现为耐药，其中对氨苄西林和链霉素全部耐药。
讨论
不同国家或地区以及不同饲养管理模式下的沙门氏菌分离率存在着明显差异。2017年的一项研究表明，鹅、鸭等水禽是沙门氏菌感染率较高的动物之一。2006—2012年我国12个省7个地区鹅中的沙门氏菌检出率为12.4%，是被检家禽种类中沙门氏菌分离率最高的。2013年欧盟报告的鹅源沙门氏菌分离率为8.4%，波兰东南部鹅群中的沙门氏菌分离率为5%。本研究发现，和田地区鹅场沙门氏菌分离率（1.81%）高于德克萨斯州水禽分离率（0.5%），但低于安徽省（14%）、山东省（26%）和江苏省（11%），表明新疆和田地区两鹅场与其他地区相比感染情况并不严重，与新疆地区近5年研究报道的沙门氏菌阳性率（1%~11%）较为一致。由于不同地区的环境气候或者饲养管理存在差异等，各地区的沙门氏菌血清型流行情况也不同。本研究对两鹅场分离出的沙门氏菌进行血清型鉴定，结果发现鼠伤寒沙门氏菌（42.86%）为优势血清型，其次为肠炎沙门氏菌（21.43%），与我国监测的散发性沙门氏菌感染中的常见血清型基本一致。四川省鸭源鼠伤寒沙门氏菌占37.5%，肠炎型沙门氏菌占14.6%，与本研究结果较为相似；华东地区报道的禽类沙门氏菌优势血清型为鸡白痢沙门氏菌，与本研究结果有所不同。根据不同鹅场的样本分析，A场中肠炎沙门氏菌为优势血清型（33.3%），与美国（FoodNet）2013—2016年公布的食源性沙门氏菌优势血清型基本一致。A场中流行的沙门氏菌血清型种类较多，共有4种。而B场血清型种类单一，均为鼠伤寒沙门氏菌（100%），与我国新疆地区2010—2015年发布的主要流行沙门氏菌血清型和欧洲报道的沙门氏菌优势血清型基本一致。两鹅场分离到的沙门氏菌优势血清型种类差异较为明显。本次调查发现，A场还存在德比沙门氏菌及纽兰沙门氏菌这两种血清型。因此，加强鹅场沙门氏菌监测和流行病学调查，对于沙门氏菌病预防和诊治有十分重要的意义。临床上抗菌药物的广泛使用是沙门氏菌对多种抗菌药物产生耐药性的重要原因。不同地区，即使同种抗生素也存在一定的耐药性差异。2019年江苏省沙门氏菌药敏结果显示，沙门氏菌对氨苄西林和磺胺异恶唑耐药率（42.5%）最高；2017年安徽省鹅场沙门氏菌药敏检测结果显示，沙门氏菌对氨苄西林和链霉素耐药，与本试验的耐药情况基本一致。本研究中，沙门氏菌分离株对多黏菌素B、哌拉西林-他唑巴坦、阿莫西林-棒酸和头孢吡肟较为敏感，耐药率（10%~20%）较低，与辽宁省鹅源沙门氏菌对多黏菌素B的敏感率较为相似，但其他抗菌药物的药物敏感度与本研究结果有所差异。新疆地区报道的鸡源沙门氏菌对环丙沙星的耐药率（83.8%）最高，与本研究的环丙沙星耐药率（60%）有明显差异。四川、河南、广西、广东和江西5个地区对动物源沙门氏菌进行了β-内酰胺酶类药敏试验，发现分离的沙门氏菌菌株对第1代头孢类药物头孢唑啉、第3代头孢类药物头孢噻呋具有严重的耐药性，同时对氨苄西林、阿莫西林、氨曲南等药物也有耐药性，而第2代头孢类药物头孢西丁、第3代头孢类药物头孢曲松、第4代头孢类药物头孢吡肟，对其有着较强的抑制作用，与本研究的沙门氏菌分离株对β-内酰胺酶类药物中的氨苄西林、氨曲南、头孢噻肟等的耐药情况基本一致。总体来说，本研究中的沙门氏菌菌株对氨基糖苷类药物、喹诺酮类药物、青霉素类药物、磺胺类药物、四环素类药物以及氯霉素药物均具有耐药性，对部分β-内酰胺酶类抗菌药物以及多黏菌素B敏感性较高。耐药性的产生因素有很多，比如药物使用情况、菌体自身情况以及所携带耐药基因种类等。鹅场常用的抗生素药物为头孢噻呋和头孢喹肟，均属于β-内酰胺酶类抗生素中的第3代头孢类药物，与本研究中耐药率较高的氨苄西林、头孢噻肟和氯霉素同属于β-内酰胺酶类药物，其中头孢噻肟与头孢喹肟和头孢噻呋同属于第3代头孢类药物，说明鹅场使用的药物对鹅场沙门氏菌菌株的耐药性产生了影响，导致鹅场沙门氏菌菌株的耐药情况较为严峻。因此，在临床上使用抗生素类药物时，要根据鹅场日常的用药情况进行具体分析。
结论
研究发现：新疆和田地区鹅源沙门氏菌流行的血清型较为复杂，其中鼠伤寒沙门氏菌为优势血清型，但不同养殖场流行的血清型种类及优势血清型存在差异；流行的鹅源沙门氏菌耐药较为普遍，且均为多重耐药。因此，需要根据各场具体的流行血清型菌株情况，科学指导临床中的抗菌药物使用。
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