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一例产气荚膜梭菌与大肠杆菌、猪圆环病毒混合感染的诊治
邵洋洋，陈胜男，林金森，钟汝情，邹育根，谢 莹，李佳明，陈菲菲，张 杰，郭文娥
（广州中科基因检测服务有限公司，广东 广州 510000）
产气荚膜梭菌又称魏氏梭菌，是一种重要的人畜共患致病菌，可分为 A、B、C、D、E 型，在猪群中主要流行A、C 型，A 型主要产生α- 毒素，产生肠毒血症，导致中、大猪的突然死亡；C 型主要产生α、β- 毒素，是造成仔猪红痢的主要病因。其普遍存在于人畜粪便、土壤、水、尘埃中，加之夏季高温高湿气候、雨水多等因素，加快了细菌、病毒繁殖扩散和传播速度，极易造成产气荚膜梭菌等一些自然疫源性疫病的流行。产气荚膜梭菌常与巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌混合感染，使病情更加严重。
发病情况与剖检症状
2021 年8 月份，广西某大型种猪场引进后备种猪后，猪群出现精神沉郁、眼屎泪斑增多、群体腹泻。随后陆续出现呼吸急促，腹围迅速膨大，有腹痛表现，卧地不起，伴有体温升高等症状，并且不断出现死亡猪只。剖检可见血性的心包积液，腹腔脏器浆膜纤维蛋白渗出，全身性感染继发肺部感染，导致肺部高度水肿、器官带有泡沫性液体，血源性散播导致干泛区域至全肺可见小叶性病变，手触有细小颗粒感，从细支气管内可挤出黏性、脓性分泌物，肝脏淤血肿大、肝出血，小肠出血、空肠及回肠严重鼓气，腹股沟浅淋巴结肿大呈黑紫色、切面呈大理石样，急性出血性淋巴结炎（见图1）。
图1 发病猪只病理解剖图
实验室检测
细菌的分离鉴定
取干净的载玻片，表面用点燃的酒精棉进行擦拭消毒，无菌操作切出一小块肺脏组织，再用新鲜切面进行触片，以酒精灯火焰固定，进行革兰氏染色镜检。肺脏触片经革兰氏染色可见优势菌，革兰氏阳性粗壮杆菌、两头钝圆、菌体大小为（0.9~1.3）×（3.0~9.0）μm、无鞭毛、未见芽孢；革兰氏染色阴性菌、无芽孢、两端钝圆的短杆菌（见图2）。
A: 革兰氏阳性杆菌；B: 革兰氏阴性杆菌
图2 肺脏触片镜检结果（H.E. 染色10×）
分离培养
无菌操作用接种环在新鲜的肺脏和肝脏切面蘸取少量组织，在血琼脂培养基进行过“Z”字形划线，将上述培养基置于37℃恒温需氧培养箱中培养24 h。重新切取新鲜组织，在加有1% 的NAD 血琼脂培养基进行划线，37℃厌氧培养箱中培养24 h。
过夜需氧培养的血琼脂培养基上有大量密集的白色呈中等大小的菌落，镜检为革兰氏阴性杆菌; 厌氧培养箱过夜培养的血琼脂培养基上长有中等大小有溶血环的菌落，镜检为粗短大杆菌，两端钝圆，单个或成双排列，偶见链状的革兰氏阳性杆菌（见图3）。
图3 肺脏触片镜检结果（H.E. 染色10×）
16S rRNA 测序及序列分析
挑取单个阴性菌落接种到普通肉汤中，置于培养箱中恒温振荡培养增菌；阳性菌落接种到液体硫乙醇酸盐培养基厌氧培养。取过夜培养的菌液，利用通用引物扩增细菌的16S rRNA。Es Taq MasterMix 聚合酶PCR 反应体系20 μL， 其中2×Es Taq MasterMix 10 μL，上下游引物各1 μL，细菌模板2 μL，加灭菌超纯水4 μL。PCR 扩增程序为，94℃预变性5 min，94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸20 s，30 个循环；最后72 ℃ 延伸5 min。PCR 产物经1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定后，均扩增出约1 428 bp的片段与目的条带大小一致（ 见图 4）；PCR 产物送广州擎科生物技术有限公司测序，所得序列进行BLAST 比对分析。分别将2 株分离菌的16S rRNA 测序结果进行BLAST 比对，确定革兰氏阳性菌测序结果比对为产气荚膜梭菌型D型，革兰氏阴性菌测序结果比对为大肠杆菌。
M.DL2 000;1. 阳性对照；2. 样品；3. 阴性对照图4 16S rRNA PCR 产物电泳图
大肠杆菌和产气荚膜梭菌药物敏感试验
采用琼脂扩散法（K-B）测定大肠杆菌和产气荚膜梭菌对猪场常用抗菌类药物的敏感性。用无菌接种环挑取单个菌落，将确定好的药敏纸片分贴到平板表面。37℃培养16~24 h 以后，测量各药敏纸片抑菌圈直径，结果见表1、表2。
常规病毒q-PCR 检测
无菌采集病死猪的肝脏、肺脏、淋巴结，加入5 倍体积的PBS，组织研磨仪研磨后离心，取200 μL上清液，使用核酸自动提取仪提取核酸，用世纪元亨商品化试剂盒检测猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒2 型、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒。结果表明，病料中除猪圆环病毒2型，其他病原均为阴性。
防治措施
全群饲料添加地美硝唑20%2.5 kg/t、复方阿莫西林10% 2~3 kg/t以及恩诺沙星1 kg/t，另外可适当添加保肝颗粒防止用药时间长对肝损伤严重。对于严重的个体病例，肌注板蓝根注射液0.1~0.2 mL/kg 用以中和内毒素、头孢噻肟注射液、恩诺沙星注射液；后续猪群逐渐稳定，死亡率降低；但仍要做到加强饲养管理，做好预防保健。不同栋舍人员严格隔离，专人专岗不能随意串舍串岗；对发病的猪只做到及时隔离、及早治疗，防止疾病的交叉传播；另外对该猪群的免疫程序进行核查，补打猪圆环病毒疫苗，同时做好猪瘟、猪蓝耳病、猪伪狂犬病等常见病毒病疫苗的免疫，提高猪群整体免疫力；加强环境管理，对产房、猪舍、周围环境做好消毒工作，控制好猪舍温度、湿度，夏季保持通风、冬季防止贼风侵入。
讨论
自从2020 年7 月饲料全面禁抗以来，全国猪场细菌性感染的病例逐渐增加，肠道有害病原菌得不到有效地控制，加之饲料高温、水源酸化、消毒，以前从饲料和水源中能得到有益菌补充这一途径被切断，没有了有益菌的平衡作用，有害菌过量繁殖以梭菌性疾病、大肠杆菌、沙门氏菌等全身性感染尤为常见，猪群肠道健康问题突出，导致育肥阶段特别是保育阶段的腹泻率增加、成活率下降，最终生长变缓、料重比增加，经济效益直接下降。加之后非洲猪瘟时代行情低迷，常规免疫程序未能完全执行，导致猪群整体免疫力下降，因此在应激或者免疫抑制性疾病（如猪圆环病毒病等）存在情况下，很容易导致细菌性疾病的全身感染，给临床兽医的诊断治疗带来困难。
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