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规模猪场猪呼吸道疾病病原诊断实例分析
李东风1，秦子昂2，王丽霞2，陈芳芳2，常红3
（1.安徽省兽药饲料监察所，安徽合肥230091；2.安徽洪桥中科基因技术有限公司，安徽合肥231131；3.山西省检验检测中心，山西太原030012）
猪呼吸道疾病在规模猪场多发和常见，往往是细菌性和病毒性疾病混合感染。目前，猪场对猪呼吸道病原菌的检测步骤主要为病症观察，病料收集，病料培养基接种，抗体检测，细菌的分离、纯化、鉴定，核酸电泳等。现将安徽某猪场出现呼吸道症状的病猪病原分离鉴定案例报告如下：
01
材料与方法
病料来源病料来源于安徽某发病猪场60日龄小猪，具有呼吸困难、高热昏睡、肺部纤维素样病变等呼吸道系统症状，送检两块肺部组织。
对病原菌进行分离和纯化，得到a菌、b菌和c菌3种单个菌落。恒温箱中37℃培养18h。
用革兰氏染液进行快速染色，置于显微镜下，于载玻片上滴上香柏油1滴，用1000×油镜镜检。
将纯化后的3种菌，用接种针分别挑取单个菌落，接种于TSB液体培养基中，加入等体积的甘油封装保存备用。
进行药敏试验的药品有：头孢噻呋（Ceftiofur）、恩诺沙星（Enrofloxacin）、替米考星（Tilmicosin）、氟苯尼考（Florfenicol）、氨苄西林（Ampicillin）、泰妙菌素（Tiamulin）、链霉素（Streptomycin）、环丙沙星（Ciprofloxacin）、阿莫西林（Amoxicillin）共9种。
分别进行猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌、猪链球菌的荧光PCR检测。判定标准为：有扩增曲线且Ct值≤35为阳性；35＜Ct值≤38为可疑；Ct值＞38为阴性。
02
结果与分析
2.1病料接种
肺组织接种的TSA平板区域生长有3种形态的菌落。一种无色透明、光滑湿润、边缘整齐、针尖状菌落，另外两种菌落形态特征相似，其一呈半透明、表面光滑湿润、露珠状的圆形菌落；其二呈半透明、表面光滑湿润、露珠状的圆形菌落。结果如图1。
2.2革兰氏染色镜检
经过革兰氏染色后，置于油镜下观察：a菌呈革兰氏阴性短小丝状杆菌，两头钝圆；b 菌呈革兰氏阳性球菌，单个或多个链状排列；c菌呈呈革兰氏阳性球菌，单个或多个链状排列。故a 疑似副猪嗜血杆菌，b 和c 疑似为猪链球菌。染色结果如图2 和图3。
2.3 溶血试验和卫星试验
取两块血平板接种环分别挑取b 菌和c 菌单菌落进行四区划线接种，恒温箱中37±1℃培养18~24 h得到纯化后的细菌。其中在TSA 上的3 种菌菌落形态与初步分离时相同，在血平板上的细菌呈细小圆形、边缘整齐并有溶血环现象，试验结果如图4，符合链球菌的菌落特征。另取血平板1 块，挑取纯化后的a 菌单个菌落，在血平板上横向平行划线，灼烧接种环，再从金黄色葡萄球菌标准菌株平板上挑取金黄色葡萄球菌，在血平板左右各三分之一处垂直于a 菌的线划线，恒温箱中37℃培养18 h，进行卫星实验。实验结果如图5，a 菌大多数集中于金黄色葡萄球菌的周围生长，分布密集，远离金黄色球菌的地方菌落稀疏。
2.4 氧化酶和触酶试验结果
触酶试验观察到a 有产生大量气泡的现象，记为触酶阳性。b 和c 没有气泡产生记为触酶阴性。氧化酶试验观察到a 菌的试纸在1 min之内变为蓝紫色，记为氧化酶阳性。b 和c 菌的试纸没有变色，记为氧化酶阴性。
以上细菌鉴定结果如表1 所示。
2.5 病原菌生物学鉴定结果
根据初步实验结果来看，a 菌疑似副猪嗜血杆菌；b 菌和c 菌疑似猪链球菌，依此为进一步试验的基础结论。
2.6 荧光PCR 鉴定
猪链球菌PCR 扩增结果如图6所示，阳性对照Ct 值处于正常范围内，且b 菌和c 菌Ct 值均小于阳性对照，故判定病料存在猪链球菌感染。
副猪嗜血杆菌PCR 扩增结果如图7 所示，阳性对照Ct 值处于正常范围内，且a 菌Ct 值＜ 35，故判定病料存在副猪嗜血杆菌感染。
猪圆环病毒2 型PCR 扩增结果如图8 所示，阳性对照Ct 值处于正常范围内，35 ＜样品Ct 值≤ 38，故结果判定为可疑，该猪可能存在猪圆环病毒2 型感染。
猪繁殖与呼吸综合征病毒PCR扩增结果如图9所示，样品无Ct值，判定为该猪没有猪繁殖与呼吸综合征病毒感染。
2.7琼脂糖凝胶电泳结果
由图10电泳图谱可知，样品的bp值位于750bp和1000bp之间，位置与阳性对照相同，bp值为822bp，故a菌为副猪嗜血杆菌。
2.8药敏试验结果
药敏试验结果如表2所示。副猪嗜血杆菌对头孢噻呋、恩诺沙星、氟苯尼考、阿莫西林敏感性极高，对替米考星、泰妙菌素中度敏感，对氨苄西林、链霉素、环丙沙星耐药。猪链球菌对头孢噻呋、恩诺沙星敏感性极高，对氨苄西林、泰妙菌素、阿莫西林中度敏感，对替米考星、氟苯尼考、链霉素、环丙沙星耐药。
03
讨论
本实验成功从样品肺组织中分离出副猪嗜血杆菌和猪链球菌，并检测出病料组织存在猪圆环病毒2型感染，不存在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染。对于猪呼吸道病原的鉴定，首先应当根据临床症状以及发病前的管理程序结合当地流行病学史初步确定可能的病原体，再取病猪临床症状明显的组织或器官如肺、喉头接种于营养成分丰富的培养基如TSA，确保苛养菌能够正常生长。对培养出来的菌落观察其形态特征，通过革兰氏染色镜检进一步筛选出符合条件的细菌并做出假设。随后进行氧化酶试验和触酶试验，初步验证假设后进行荧光PCR鉴定和琼脂糖凝胶电泳鉴定。该鉴定过程中时刻需要注意无菌操作，所有器材使用前必须经高压灭菌，实验过程中必须全程在超净工作台和生物安全柜中进行。细菌的初步分离纯化是鉴定过程中最关键的步骤，必须纯化出单个菌落才能进行之后的实验操作，因此操作者应熟练四区划线手法，一区划线后需要对接种环进行灼烧后才能继续划线，否则很难生长出单个菌落。
此方法能够在48h内迅速确定病原体，操作简洁，步骤严谨、符合逻辑，且鉴定所需仪器试剂和设备中小型猪场实验室内均可设立。普通PCR需要人工进行核酸提取，需要多次添加试剂进行离心，操作复杂且样品易受污染。而本实验采取的荧光PCR只需使用商业化的PCR检测试剂盒，加入模板和引物后放入荧光PCR仪中，选择设定好的程序即可进行PCR反应，且通常反应在1~3h内，通过反应的Ct值即可判断感染情况。
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