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摘要：为调查石河子市牛源大肠杆菌对β-内酰胺类药物的耐药表型和耐药基因携带情况，采集健康牛群粪便，采用常规细菌分离鉴定方法并结合16S rRNA PCR检测方法进行分离鉴定；参考Clermont方法对分离菌株进行系统分子分群，采用PCR方法检测分离菌株的β-内酰胺类耐药基因blaCTX-M、blaOXA、blaSHV和blaTEM携带情况，通过K-B纸片法测定分离菌株耐药表型。结果显示：分离鉴定出100株牛肠道大肠杆菌分属于A、B1、C和F群；分离株对头孢唑林和阿莫西林的耐药率在50%以上，对氨苄西林、头孢氨苄与头孢吡肟的耐药率均在5%以下，所有分离株对头孢吡肟敏感；5株分离菌株检测到blaSHV基因片段，1株检测到blaCTX-M基因片段，所有菌株均未检测到blaOXA和blaTEM基因片段。结果表明，石河子市牛源正常大肠杆菌已少部分携带耐药基因，且对部分β-内酰胺类药物产生了耐药性。结果提示，应加快减抗政策的实施。大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）是一种重要的人兽共患食源性病原菌。新疆是我国重要的养牛地区，牛饲养量逐年增加，牛大肠杆菌病时有发生。大肠杆菌在规模化养殖场可引起犊牛腹泻、出血性肠炎、肺炎、脑炎以及败血症等病症，给养殖业带来了较为严重的经济损失。同时大肠杆菌也是组成人和动物消化道正常菌群的重要细菌，在维持机体生态平衡和健康状态方面发挥着重要作用。研究显示，来自健康动物的大肠杆菌也表现出越来越明显的耐药特性。而肠道是大肠杆菌的最大贮存库，其耐药性可以通过食物链和直接接触传递，因此给公共卫生带来了一定的潜在威胁。McGowan等证实，存在于少数细菌中的碳青霉烯酶已经在一些重要的肠道菌群中被发现。目前兽医临床控制或治疗细菌性病原引起的感染主要使用抗生素。而抗生素的广泛使用，导致致病性大肠杆菌多重耐药菌株不断出现，使大肠杆菌病防治效果明显降低。研究表明，β-内酰胺类抗生素是牛场常用的一类药物，而耐药细菌主要通过产生β-内酰胺水解酶来抑制β-内酰胺类药物的耐药活性。顾晓晓等研究报道，新疆部分地区牛、羊致病性大肠杆菌对头孢唑林、阿莫西林等药物具有一定耐药性。目前，研究石河子市牛源正常菌群大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素的耐药表型和相关耐药基因携带情况的报道较少。因此，本研究在分离鉴定健康牛肠道正常大肠杆菌基础上，分析分离株对部分β-内酰胺类抗生素的耐药表型和相关耐药基因携带情况，以期为牛源致病性大肠杆菌耐药机制的深入研究以及石河子市减抗政策的加速实施提供依据。
材料与方法
材料粪便来源 无菌采集新疆石河子市规模化牛场健康牛粪便样本。主要试剂与培养基 2×Taq DNA 聚合酶、2×PCR Buffer、2×dNTP、LB培养基、DL 2 000 DNA Marker等，均为TaKaRa公司产品；伊红美蓝琼脂培养基、麦康凯培养基，购自青岛海博生物技术有限公司。引物设计与合成 根据参考文献，设计大肠杆菌通用引物16S rRNA，分子分型arpA、chuA、yjaA及TspE4.C2基因引物，β-内酰胺类耐药基因CTX-M、OXA、TEM及SHV引物。引物均由华大基因有限公司制备合成。相关信息见表1。
药敏纸片种类及规格 β-内酰胺类药物药敏纸片种类及规格：头孢唑林（Cefazolin）30 μg、阿莫西林（Amoxicillin）20 μg、头孢拉定（Cefradine）30 μg、青霉素（Penicillin）10 U、头孢噻肟（Cefotaxime）30 μg、头孢西丁（Cefoxitin）30 μg、头孢噻吩（Cephalothin）30 μg、氨苄西林（Ampicillin）10 μg、头孢氨苄（Cephalexin）30 μg、头孢吡肟（Cefepime）30 μg。药敏纸片均由杭州微生物试剂有限公司合成制备。方法细菌分离鉴定 将无菌采集的样本稀释涂布于LB培养基上，放置于恒温箱中37 ℃恒温培养12 h，观察培养基上的菌落形态；将符合要求的疑似菌接种于伊红美蓝培养基和麦康凯培养基进行纯化，37 ℃恒温培养12 h；选取伊红美蓝培养基上的特征性菌落进行涂片，革兰染色镜检。选取疑似菌进行生化鉴定，包括葡萄糖发酵、乳糖发酵、IMViC（靛基质试验、甲基红试验、乙二酰试验、柠檬酸盐利用试验）。细菌16S rRNA序列分析 以提取的分离菌基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增16S rRNA序列，PCR反应均在20 μL体系中进行。PCR总体系反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。取6 μL扩增后产物，经2.0%琼脂糖凝胶电泳后使用凝胶成像系统拍照分析结果。分离株系统进化分群 参考Clermont判定标准，采用多重PCR方法进行系统分群。PCR反应均在50 μL反应体系中进行。PCR体系反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸110 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳后分析结果。细菌耐药基因PCR检测 根据参考文献合成耐药基因，包括 CTX-M、OXA、TEM、SHV。引物信息见表1。在提取分离菌DNA基础上进行PCR扩增。PCR反应体系为40 μL。总体系反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火30 s（退火温度见表1），72 ℃延伸50 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳后分析结果。耐药表型检测 参照CLSI于2012年制定的药敏纸片琼脂扩散法标准（K-B法），将分离菌菌液浓度调节至0.5麦氏比浊度，取200 μL均匀涂布在LB平板上，静置5 min，待菌液不流动后，使用镊子将药敏纸片贴于平板上，纸片间距不少于24 mm，纸片中心距平板边缘不少于15 mm。将平板倒置于恒温箱内37 ℃，培养16 h，检测分离菌对10种抗生素的耐药表型。根据抑菌圈大小判断分离细菌对药物的敏感性。
结果
细菌分离鉴定分离株在LB培养基上生长出白色、圆润、表面略凸、边缘光滑的小菌落，在麦康凯培养基上生长出红色、圆润、表面微凸、边缘光滑的菌落，在伊红美蓝培养基上生长出黑色、光滑、表面微凸、边缘光滑带金属光泽的小菌落（图1）。镜检结果显示：分离菌株为革兰染色红色阴性、两端钝圆的短小杆菌，与大肠杆菌特点一致。
经16S rRNA基因序列PCR扩增、电泳，最终扩增出大小约100 bp目的基因条带（图2）。测序结果（图3）显示，分离株与GenBank中相应基因序列同源性在99%以上。结合生化反应与16S rRNA基因序列分析结果，确定分离菌株为大肠杆菌。
分离株系统进化分群采用Clermont的四重PCR扩增方法，进行arpA、chuA、yjaA和TspE4.C2目的基因扩增、电泳。结果显示：100株大肠杆菌中，38株属于A群大肠杆菌，53株属于B1群大肠杆菌，7株属于C群大肠杆菌，2株属于F群大肠杆菌。部分分型结果见图4。
细菌耐药基因PCR检测对100株大肠杆菌进行blaCTX-M、blaOXA、blaTEM和blaSHV耐药基因PCR扩增，结果在5株分离菌中检测到blaSHV基因，1株中检测到blaCTX-M基因，未检测到blaOXA和blaTEM基因片段。部分结果见图5。
药物敏感性试验分离菌株对头孢唑林的耐药性最高，对头孢吡肟的敏感性最高（表2）。抗1种药物的有16株，占16%；抗2种药物的有32株，占32%；抗3种药物的有21株，占21%；抗4种药物的有10株，占10%；抗5种药物的有10株，占10%；抗6种药物的有1株，占1%。耐药菌株占总菌株数的90%。各分群的耐药表型测定结果（表3）显示：A群大肠杆菌对头孢唑林、阿莫西林、头孢拉定耐药率分别为57.89%、50.00%、47.37%，B1群大肠杆菌对头孢唑林、头孢拉定、阿莫西林、青霉素耐药率分别为77.36%、52.83%、50.94%、33.96%，C群大肠杆菌对阿莫西林、头孢唑林耐药率分别为71.43%、57.14%，F群大肠杆菌对头孢唑林、青霉素、头孢拉定耐药率均为100%。
讨论
16S rRNA基因存在于所有生物的染色体基因组中，具有高度保守性，因此在细菌分离鉴定时，除了用常规生化反应鉴定外，结合16S rRNA进行 PCR扩增，能更准确完成细菌鉴定。根据毒力基因建立的系统发育群系，将大肠杆菌分为7个系统发育类群，即A、B1、B2、C、D、E和F，其中强毒性肠外菌株主要属于B2群，也有部分属于D群，而大多数共生菌株属于A群。本研究中的100株分离菌与Clermont分型结果基本一致。致病性大肠杆菌感染的控制与治疗主要依靠抗生素，因而导致不同来源致病性大肠杆菌对不同抗生素表现广泛的耐药性。而动物肠道中存在的正常菌群大肠杆菌，也对不同抗菌药物逐渐表现出不同程度的耐药性，这给动物本身和人类生物安全带来了潜在威胁。本研究中，来自牛肠道正常菌群大肠杆菌对β-内酰胺类部分抗菌药的耐药率虽然低于顾晓晓等报道的新疆部分地区牛、羊致病性大肠杆菌对相应抗生素的耐药率，但对头孢唑林、阿莫西林的耐药率分别达到69%和52%，与张济培等、韦庆兰等对水禽源大肠杆菌的耐药性检测结果类似。本研究中，A群分离菌对头孢唑林、阿莫西林、头孢拉定的耐药率较高，B1群分离菌对头孢唑林、头孢拉定、阿莫西林、青霉素的耐药率较高，C群分离菌对阿莫西林、头孢唑林的耐药率相对较高，F群分离菌对头孢唑林、青霉素、头孢拉定的耐药菌株占比均为100%，表明正常肠道大肠杆菌对青霉素类抗生素以及部分一代头孢菌素类药物具有较高的耐药性，而耐药性和菌株Clermont分型无明显关系。研究表明，blaSHV主要与青霉素类抗生素如阿莫西林耐药基因相关，blaCTX-M与头孢噻吩等抗生素耐药基因相关，blaOXA与三代头孢菌素类抗生素如头孢西丁耐药基因相关，blaTEM与氨苄西林、青霉素及头孢噻吩类抗生素耐药基因相关。冀亚路等对吉林省规模化猪场断奶仔猪进行大肠杆菌耐药基因分析发现，blaTEM和blaCTX检测率分别为30.8%和15.4%，而blaSHV检测率为0；表型检测发现，对青霉素耐药率为99.8%，阿莫西林为81.6%，氨苄西林为100%。王蕾等在乌蒙地区进行威宁黄牛粪源大肠杆菌研究发现，blaTEM和blaSHV检出率分别为24%和19%，对青霉素耐药率只有13%。本研究的100株分离菌株中，有1株检测到blaCTX-M基因，5株检测到blaSHV基因，均未检测到blaOXA和blaTEM基因。本研究结果与其他动物粪源大肠杆菌携带耐药基因情况存在明显差异，推测不同地区、不同来源大肠杆菌可能与地区用药、菌群差异以及耐药基因的传递方式有关。此外，本研究发现，耐药表型与耐药基因检出率也有不一致现象，如blaSHV基因检出率最高，而阿莫西林在耐药表型检测中的耐药率超过了50%，青霉素仅为26%，其中是否存在其他未检/未发现的耐药基因或其他机制介导的耐药，还需要进一步研究。牛正常肠道菌群细菌耐药性普遍增强的现象提示，应加快减抗政策的实施。
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