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摘 要：
为了评价8种抗病毒药物治疗禽流感的临床效果，试验选取了80只21日龄的SPF鸡，分为空白组、攻毒对照组和8个药品组，攻毒对照组和8个药品组分别滴鼻攻毒100μL（病毒含量为104.5EID50/mL）的H9N2亚型禽流感病毒。攻毒后第2天饮水给药，连续观察14 d并记录其体重、发病情况，计算死亡率、保护率，并于攻毒后第5、10、14天采血检测抗体水平。试验结果表明：空白组SPF鸡全部存活，攻毒对照组全部死亡。药品2组（板蓝根、大青叶）的保护率最高，为62.5%；最低的为药品4组（干扰素）和5组（多肽），均为0%。说明板蓝根和大青叶在0.2 g/100 mL的浓度下具有较好的防治禽流感的效果，为生产实践中禽流感的防治提供参考依据。
关键词：禽流感;抗病毒药物;保护率;
H9N2亚型禽流感病毒，属于低致病性禽流感病毒，单独感染鸡会引起轻微的呼吸道症状，可以排毒，当与其它病毒（如新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等）发生混合感染，会导致呼吸道症状加重，死亡率上升[1]。H9N2亚型禽流感对养禽业的危害不容忽视，该病毒虽然毒性较H5N1弱，但同样可以引起养禽业的损失。过去二十年来，H9N2禽流感病毒在全球家禽中广泛传播，对养禽业构成威胁，需要密切监视、加强防控。
禽流感的防治除了疫苗免疫接种外，临床上大多采用抗病毒药物进行防治。目前用于临床治疗禽流感药物主要有以下几类：第一类是化学合成的抗病毒药，如金刚烷胺、利巴韦林等，但大都被禁止用于兽药；第二类为生物合成制剂，如干扰素、单克隆抗体、转移因子等，干扰素作为一种新型抗病毒药物，静脉注射可随血液循环至全身，激活细胞内作用机制以抵抗病毒的侵扰[2]；转移因子在一定幅度内能提高抗体水平并能延长抗体维持时间[3]；第三类为传统的抗病毒中药，如大青叶、板蓝根、黄连、金银花等清热解毒类中药。再就是近几年较流行的多糖多肽类药物，也陆续用于临床，如有研究报道浒苔多糖在体外有抗禽流感病毒的活性[4]。总之，抗流感病毒药物的种类繁多，为筛选临床防治H9N2亚型禽流感的有效药物，本试验选取SPF鸡评估了8种药物治疗禽流感的临床效果，为生产实践中禽流感的防治提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验动物及毒株
21日龄SPF鸡、SPF鸡胚均购自山东斯帕法斯生物技术有限公司。H9N2禽流感病毒（尿囊液），为本实验室保存，攻毒前经SPF鸡胚传代一次。
1.2 试验药品及试剂
8种药物编号为药品1、2、3、4、5、6、7、8，由青岛中仁药品有限公司提供。1%鸡红细胞悬液自制；H9N2禽流感标准阳性血清，购自哈尔滨维科生物公司；待检鸡血清。具体药物见表1。
1.3 主要仪器
超净工作台，购自力康精密科技（上海）有限公司；高速离心机，购自长沙东旺实验仪器有限公司；孵化箱，购自佳农电子设备有限公司；电子分析天平，购自奥豪斯仪器（常州）有限公司。
1.4 试验方法
1.4.1 攻毒试验
取出-80℃保存的AIV种毒，过滤病毒后感染鸡胚收获尿囊液，用0.9%的无菌生理盐水作10倍递进稀释，接种于9日龄SPF鸡胚，37℃培养5 d，观察并记录鸡胚死亡感染情况。经测定H9N2禽流感病毒含量为104.5EID50/m L。
选取9只体重相近21日龄SPF鸡，随机分为3组，每组3只，分别采用稀释不同浓度的尿囊液0.1 m L滴鼻攻毒，观察感染及死亡情况。然后分别采用上述结果中适当浓度0.1、0.2 m L两个剂量进行攻毒，观察感染及死亡状况，确定正式攻毒的浓度与剂量。
1.4.2 试验分组与处理
试验选取80只21日龄SPF鸡，随机分成10组，设置空白组、攻毒对照组和8个药品组，攻毒对照组和8个药品组的SPF鸡滴鼻攻毒100μL(104.5EID50/m L）的H9N2禽流感病毒液，每组做好标记（表2）。空白组和其它组隔离饲养，攻毒后第2天开始全天饮水给药，每天早中晚各三次，现用现配。
1.4.3 临床症状
每天详细记录各组SPF鸡的临床症状，发病和死亡情况等指标。若发现雏鸡死亡，立即将其解剖，记录各组织器官的病理变化。各组SPF鸡每天空腹称重1次，计算日增重。
1.4.4 保护率的测定
根据发病率、死亡率计算出保护率。
1.4.5 抗体水平检测
对照组及所有药品组在攻毒前及攻毒第5、10、14天，每组随机抽取3只鸡，采血离心取血清保存备用。采用血凝及血凝抑制试验的方法[5]检测抗体，使用抗原为攻毒毒株。
2 结果
2.1 临床症状
攻毒对照组的SPF鸡在第3～4天开始出现典型的AIV病变，羽毛脏乱堆挤在一起，精神萎靡不振，脚趾鳞片轻微出血，卧伏于笼中，不爱走动，饲料用量、饮水量减少，偶尔有咳嗽、喷嚏和支气管啰音等现象，喘息时有鸣声。排黄白色粥样稀粪，并在攻毒后第2天出现体重下降。空白对照组的SPF鸡未出现任何的临床症状，精神正常，体重逐步增加。药品组的SPF鸡在第3～4天也开始出现不同程度的临床症状，第2天出现体重下降，第3天有所回升，后期体重逐渐下降，如图1。
2.2 攻毒试验结果
攻毒剂量筛选确定攻毒浓度为103.5EID50浓度，剂量0.1 m L。攻毒对照组在3 d开始陆续出现死亡，各药品组于6 d后陆续出现死亡。于第11天统计各组的死亡率和保护率，攻毒试验结果如表3。
2.3 病理剖检
攻毒对照组和药品组的SPF鸡死亡后，发现羽毛脏乱、消瘦，肛门周围被排泄物污染。剖检可见小肠粘膜出血，肠壁内有出血点（图2A），肺脏出血（图2B），肾脏出血（图2C），腺胃乳头出血、肌胃角质层溃疡（图2D），如图2。空白对照组，羽毛有光泽，肛门周围无排泄物，剖检时未发现组织有病变。
2.4 抗体水平变化
对照组及所有药品组在攻毒前及攻毒第5、10、14天，每组随机抽取3只SPF鸡检测抗体，结果见表4。
注：“/”表示该组SPF鸡死亡，未能采样；“*”表示该组SPF鸡仅有一只存活。
3讨论
本试验结合生产实际，在考虑临床用药成本的基础上，按生产厂家建议临床使用浓度选定了8种不同的药物，通过SPF鸡攻毒感染，感染后用药，观察临床症状、计算保护率、抗体水平等指标，评估8种药物的临床效果。本试验结果显示，饲喂板蓝根、大青叶的抗感染效果最好，保护率和抗体水平较其它组高；浒苔多糖、核酸糖肽类药物的效果次之。
抗体效价的高低可以直接反映机体的免疫状态，抗体检测可以作为观察药物疗效的指标，也能够监测SPF鸡攻毒后是否产生反应，是临床诊断的重要依据。从抗体水平可以看出，所有SPF鸡在攻毒前均无H9N2禽流感抗体，攻毒第5天开始产生抗体；第10天各组的抗体水平均有升高，药品2、3、8组抗体水平较其它组高，但此时仍有部分SPF鸡未产生抗体，这一阶段出现大量死亡，可能是攻毒毒株的毒力较强，产生的抗体被不断消耗导致检测的抗体水平较低；至第14天仅有药品2组还有1只SPF鸡存活，抗体效价为28，抗体较高。试验结果显示，板蓝根和大青叶能够显著提高SPF鸡的抗体效价，但因条件所限，本试验检测的SPF鸡数量较少，这对药物效果的研究尚待进一步证实。
由于近几年禽流感病毒对药物的耐药性逐渐增强，新型抗病毒药物的研制越来越迫切。本试验中干扰素、转移因子等几种新型药物口服方式并不理想，可能是受口服给药途径的影响。板蓝根和大青叶是清热解毒的中草药，对甲型流感病毒有明显的拮抗作用，从而获得较好的治疗效果[6]，这与本试验结果相符。金银花和连翘具有一定的抗病毒作用，研究报道金银花的乙醇提取物对流感病毒的复制有一定的抑制作用[7]。王文丽等[8]发现连翘提取物在银翘散的主要药物组成成分中抗甲型流感病毒的作用最强。孙信仁[9]使用中药剂“病毒清”在不同药物治疗效果等方面进行比较试验，证实中药剂在治疗禽流感方面有着较为理想的效果。而在本试验中金银花、连翘的治疗效果并不理想，可能是药材价格较高、添加浓度较低的原因。本试验通过对8种不同浓度的药物进行评估，得出8种抗病毒药物中以板蓝根和大青叶的效果最好，对禽流感的防治有一定的临床参考价值。
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