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羊痘病毒属病毒通用Cycleave PCR检测方法的建立


现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2022/12/3 21:30:16 关注:622 评论: 我要投稿

  摘要:为快速特异检测羊痘病毒属病毒(CaPVs),比较了牛结节性皮肤病病毒(LSDV)、山羊痘病毒(GTPV)和绵羊痘病毒(SSPV)的全基因组序列,选择保守区域设计特异性引物和探针,建立了一种CaPVs通用的Cycleave PCR检测方法。特异性结果显示,该方法在40 min内即可检出CaPVs,与口蹄疫病毒、羊口疮病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒均无交叉反应;灵敏性结果显示,最低检出限为4.98 copies/μL;重复性结果显示,批内和批间重复变异系数均小于2%。对131份临床样本进行检测发现,该方法与世界动物卫生组织(WOAH)推荐的常规PCR方法相比,敏感性为100%,特异性为91.55%,总符合率为95.42%。以上结果表明,本研究建立的Cycleave PCR检测方法特异、敏感、重复性好,且操作简便,适用于CaPVs的高通量、快速检测。
  牛结节性皮肤病病毒(LSDV)、山羊痘病毒(GTPV)、绵羊痘病毒(SPPV)同为羊痘病毒属(CaPVs)成员,由于传播迅速且可造成重大经济损失,其导致的牛结节性皮肤病(LSD)、山羊痘(GTP)和绵羊痘(SPP)被世界动物卫生组织(WOAH)列为法定报告动物疫病。在我国,均被列为二类动物疫病。我国于2019年8月首次在新疆伊犁哈萨克自治州确诊LSD,2020年6月以来,LSD在我国境内迅速蔓延,已有福建、江西、内蒙古等十余省份报告发生。LSDV可导致泌乳牛产奶量下降,公牛短暂或永久不育,怀孕牛流产,皮革损坏,病牛有时因继发细菌感染而死亡,严重威胁养牛业持续健康发展,是我国近3年密切关注并重点防控的动物疫病之一。GTP和SPP合称羊痘,数年来在我国部分地区持续流行,2021年内蒙古、山西、河北等多地报告疫情发生。该病临床症状为发热,无毛或少毛部位的皮肤或黏膜发生红斑、丘疹、疱疹、水泡等,发病率为50%~80%,发病后成年羊死亡率达40%,羔羊死亡率可达100%,严重影响羊肉和羊毛质量。因此,开发一种可以快速准确检测CaPVs的方法对于防控上述疫病和维护牛、羊养殖产业健康稳定发展具有重要意义。
  Cycleave PCR是一类新型荧光定量PCR技术,采用1对引物和1个嵌合RNA位点的DNA探针扩增模板,探针和模板杂交后于RNA位点处切割探针而产生标记荧光,具有特异、敏感、快速及荧光背景低、信噪比高等优点,已应用于布鲁氏菌病、丙型肝炎、肺癌等畜牧兽医和医学领域疾病研究。鉴于LSDV、GTPV和SPPV基因组具有高度同源性,本研究以其共同保守区为基础,建立了一种CaPVs通用的Cycleave PCR检测方法,以期为上述疫病防治提供技术支持。
  材料与方法
  材料
  病毒、核酸和临床样本 LSDV/China/XJ/2019-1,由中国动物卫生与流行病学中心国家外来动物疫病研究中心分离鉴定;GTPV(AV41株)、口蹄疫病毒O型(FMDV/Re-O/MYA98/JSCZ2013株)、口蹄疫病毒A型(FMDV/Re-A/WH/09株)、羊口疮病毒(GO-BT15-30株)、牛病毒性腹泻病毒(NMG株)、牛传染性鼻气管炎病毒(LY株),购自市售商品化疫苗;SPPV(GL株)DNA模板,由中国农业科学院兰州兽医研究所惠赠;蓝舌病病毒DNA模板,由军事医学科学院军事兽医研究所惠赠;89份临床疑似感染LSDV牛全血、唾液、皮肤结节样品,42份临床疑似感染羊痘的山羊或绵羊全血、血清、唾液、皮肤组织核酸样品,由中国动物卫生与流行病学中心和内蒙古自治区动物疫病预防控制中心提供。
  主要仪器和试剂 全自动核酸提取仪(西安天隆公司),实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司),超微量紫外分光光度计(Thermo公司),高速冷冻离心机(Thermo公司),琼脂糖凝胶电泳仪(Bio-Rad公司),凝胶成像系统(上海天能公司)。核酸提取试剂盒(西安天隆公司),引物和探针(TaKaRa公司),Cycleave PCR试剂盒(TaKaRa公司),质粒提取试剂盒(Axygen公司),pMD19-T载体(TaKaRa公司),DH5α感受态细胞(北京全式金公司)。
  方法
  样本核酸提取 全血、血清、唾液、病毒等液体样本直接利用商品化核酸提取试剂盒和全自动核酸提取仪提取核酸;皮肤组织样品经过匀浆和离心后,取上清按相同方法提取核酸。获得的核酸样本于-20 ℃保存备用。
  引物和探针设计 从GenBank数据库中查找下载已有的全部27株LSDV、12株GTPV和13株SPPV基因组全序列。利用生物信息学软件BLAST和Lasergene MegAlign,将LSDV、GTPV、SPPV基因组全序列进行比对,分析筛选CaPVs代表性保守区域。基于上述结果,利用Cycleave? PCR Assay Designer软件,综合考虑SNP位点两翼序列的保守性、碱基组成、GC含量、二级结构形成、Tm值等因素设计Cycleave PCR反应引物及探针。本研究根据ORF028基因174~430位点设计引物和探针。CaPV-F:5'-TGGAAATRGATCCACCAGTTAAAG-3';CaPV-R:5'-TCGMACTAGCGAACATGGAA-3';CaPV-P:5'-AAGGATGAAGA-3'(下划线位置为标记的RNA位点)。其中,探针的5'端进行羧基荧光素FAM标记,3'端进行淬灭基团Eclipse标记。引物和探针与LSDV、GTPV、SPPV基因组序列配对结果见图1。

  反应体系及扩增条件 总反应体系25.0 μL,包含2×Cycleave PCR反应液12.5 μL,CaPV-F和CaPV-R(浓度均为5 pmol/μL)各1.0 μL,CaPV-P(5 pmol/μL)1.0 μL,双蒸水7.5 μL,DNA模板2.0 μL。扩增条件:95 ℃预变性10 s;95 ℃变性5 s,55 ℃退火10 s,72 ℃延伸20 s(收集FAM信号),共40个循环。被检样品扩增曲线呈现典型“S”形且Ct≤40,判定为阳性;无典型扩增曲线,判定为阴性。
  灵敏度试验 以中国流行株LSDV/China/XJ/2019-1病毒核酸为模板,采用引物CaPV-F和CaPV-R进行PCR扩增,回收PCR产物并连接pMD19-T载体,转化DH5α感受态细胞,鉴定结果与预期相符的作为阳性菌种,提取质粒作为阳性质粒。采用超微量紫外分光光度计测定阳性质粒浓度,根据质粒拷贝数(copies/μL)=(质粒浓度×10-9×稀释倍数×6.02×1023)/(660道尔顿/碱基×碱基数),计算拷贝数。对阳性质粒进行10倍梯度稀释,浓度范围为4.98×107~4.98×10-1 copies/μL。采用建立的Cycleave PCR检测方法,对上述系列稀释样品进行测定,评价本方法的最低检出限并绘制标准曲线。
  特异性试验 采用建立的Cycleave PCR方法分别对LSDV、GTPV、SPPV、口蹄疫病毒、羊口疮病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒和蓝舌病病毒核酸样品进行检测,评价方法的特异性。
  重复性试验 对浓度范围为4.98×102~4.98×106 copies/μL的阳性质粒,采用同批次配制的Cycleave PCR反应体系重复检测3次,计算批内变异系数;采用3个不同批次配制的Cycleave PCR反应体系重复检测3次,计算批间变异系数。变异系数计算公式为CV=(标准偏差SD/平均值Mean)×100%。
  临床样本检测 采用建立的Cycleave PCR方法和WOAH推荐的常规PCR方法,对89份临床疑似感染LSDV的牛核酸样品和42份临床疑似感染羊痘的山羊或绵羊核酸样品进行平行检测,比较2种方法的检测结果,计算符合率。
  结果
  阳性质粒构建
  以中国流行株LSDV/China/XJ/2019-1病毒核酸为模板,采用引物CaPV-F和CaPV-R进行PCR扩增,扩增出大小为257 bp的目的条带(图2)。构建的质粒经测序验证与预期目的基因序列相符,表明成功构建阳性质粒。

  灵敏度试验
  采用Cycleave PCR方法检测系列稀释的阳性质粒,以水作为阴性对照。结果显示,当阳性质粒浓度为4.98 copies/μL时,仍可见明显扩增曲线(图3-A);标准曲线线性方程为y = -3.380 x+45.212,R2= 1.000,扩增效率E = 97.6%,表明本方法具有较高扩增效率且在检测范围内模板浓度与检测Ct值间具有良好线性关系(图3-B)。

  特异性试验
  采用建立的Cycleave PCR方法检测相关病毒样品,以LSDV、GTPV、SPPV核酸样品作为阳性对照,水作为阴性对照。结果(图4)显示,LSDV、GTPV、SPPV核酸样品均出现典型“S”形扩增曲线,阴性对照未出现扩增信号;口蹄疫病毒、羊口疮病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒核酸样品均未出现扩增信号,说明本方法与常见牛、羊病毒无交叉反应。

  重复性试验
  采用建立的Cycleave PCR方法重复检测系列稀释的阳性质粒,结果批内重复变异系数为0.33%~0.77%,批间重复变异系数为0.80%~1.94%,均小于2%(表1),表明本方法具有良好的重复性。

  临床样品检测
  采用建立的Cycleave PCR方法和WOAH推荐的常规PCR方法平行检测131份临床样品。结果显示,Cycleave PCR检出CaPVs阳性样品66份、阴性样品65份;WOAH方法检出CaPVs阳性样品60份、阴性样品71份。与WOAH方法相比,Cycleave荧光PCR方法敏感性为100%,特异性为91.55%,总符合率为95.42%。将2种方法检测结果不一致的6份样品进行PCR扩增,回收扩增片段并测序鉴定,证实均含有CaPVs核酸序列。结果表明,Cycleave PCR方法检测结果准确可靠,与WOAH推荐的常规PCR方法符合率良好,且具有更高的阳性检出率。
  讨论
  LSDV感染后,发病率一般为5%~45%,死亡率通常在10%以下,尽管死亡率不高,但造成的经济损失较大,特别是泌乳高峰的奶牛最易感LSDV,对奶牛产业危害尤为严重。Somasundaram等研究测算,中东地区集约化奶牛场因LSD造成的直接生产损失约占总损失的45%~65%。与LSD相比,GTP和SPP的发病率和死亡率更高,由于动物死亡和存活动物生产性能下降,可导致年平均收入损失30%~43%。目前,WOAH推荐的CaPVs检测方法有病毒分离、病原检测(透射电镜、组织病理学、荧光抗体试验等)和PCR等,与前两类方法相比,常规PCR和荧光定量PCR等分子方法检测速度快且操作简便,适用于群体无疫、临床病例确诊、感染流行率监测、根除政策实施等多种检测用途,是我国基层实验室广泛应用的技术类型。
  Cycleave PCR方法以RNA和DNA构成的杂合Cycling探针与核糖核酸酶H组合使用方式,基于PCR技术实现目的基因的高效检出,其检测灵敏度高且特异性好。本研究建立的CaPVs通用Cycleave PCR检测方法,在40 min内即可特异性检出LSDV、GTPV、SPPV,且与口蹄疫病毒等常见牛、羊病毒无交叉反应;灵敏度高,最低检出限为4.98 copies/μL;重复性好,批内和批间重复变异系数均小于2%;在检测临床样品时,与WOAH推荐方法检测结果符合率良好,并具有更高的阳性检出率。
  综上,本研究建立的Cycleave PCR检测方法反应时间短、敏感特异且操作简便,适用于CaPVs的临床高通量、快速检测。

文章来源:中国动物检疫     文章作者:南文龙等     文章编辑:一米优讯     
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