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基因VI型新城疫病毒反转录数字PCR检测方法的建立与应用


现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2022/12/18 17:47:06 关注:700 评论: 我要投稿

  摘要:基因VI型新城疫病毒(NDV)是导致我国当前鸽新城疫流行的主要基因型。国家新城疫参考实验室监测数据表明,鸽NDV分离率近年来有上升趋势。为了实现基因VI型NDV快速检测和精确定量,针对国内流行的基因VI型NDV F基因保守区域设计特异性引物和探针,建立了反转录数字PCR(RT-dPCR)方法,并对该方法的灵敏度、特异性和重复性进行了评估。结果显示,建立的RT-dPCR方法线性关系良好,灵敏度高,最低检测限为1.97 copies/μL;特异性强,与其他基因型NDV强毒株和常见禽病病毒无交叉反应;重复性好,变异系数为2.2%。利用本方法对临床采集的180份鸽口咽/泄殖腔拭子样品进行检测,检测结果与病毒分离结果一致。以上结果表明,本研究建立的RT-dPCR方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于基因VI型NDV的快速检测和精准定量,同时也为基因VI型NDV核酸标准物质研制奠定了基础。
  新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)强毒株感染引起的,可危害多种禽类的烈性传染病。世界动物卫生组织(WOAH)将ND列为法定报告动物疫病,我国农业农村部将其列为二类动物疫病。鸡、鸽等易感禽类感染NDV后,发病率和死亡率可高达100%。NDV基因组全长有15 198、15 192和15 186 nt 3种长度,共包含6个基因片段,3'-NP-P-M-F-HN-L-5',其中F基因和HN基因是主要的毒力决定基因。NDV可分为Class I和Class II两类,其中强毒株均属于Class II。国家新城疫参考实验室监测数据显示,我国目前流行的强毒株主要是Class II的基因VI型和VII型,其中鸽源基因VI型NDV近年分离率明显升高。
  通过接种鸡胚进行病毒分离和RT-PCR测序鉴定是确诊ND的“金标准”,然而这些方法对生物安全要求高,步骤繁琐,耗费时间长,成本较高,不能做出快速诊断。近年来,随着分子生物学技术的发展,数字PCR(dPCR)被广泛应用于多种动物病原的精准检测。dPCR是先对模板进行预处理,将其稀释分配到许多个独立的单元,每个单元有1个目标序列的PCR微反应区,PCR扩增结束后,通过采集荧光信号进行量化(阳性记作1,阴性记作0),再引入泊松概率分布函数进行计算,从而得到样本的初始拷贝数,对样本进行绝对定量。该方法灵敏度极高,可检测到样本中低拷贝数的核酸,且大大节约了检测时间和检测成本,在动物疫病检测中具有广阔的应用前景。本研究利用dPCR技术平台,针对基因VI型NDV F基因保守区设计引物和探针,建立了一种快速、有效、灵敏度高的RT-dPCR检测方法,以期为在鸽群中开展基因VI型NDV快速检测和研制诊断用核酸标准物质奠定基础。
  材料与方法
  材料
  病毒 基因VI型、VII型、XII型NDV,H5、H7、H9亚型禽流感病毒(AIV),鸡传染性支气管炎病毒(IBV),鸡传染性喉气管炎病毒(AILTV),禽腺病毒(FAdV)等常见禽病病原,均由中国动物卫生与流行病学中心禽病监测室保存。
  临床样品 180份鸽口咽/泄殖腔拭子,由中国动物卫生与流行病学中心2021年从国内部分地区活禽市场采集。
  试剂盒 核酸提取试剂盒(High Pure Viral Nucleic Acid Kit),购自Roche公司;RT-PCR试剂盒(Primescript One Step RT-PCR Kit Ver.2),购自TaKaRa公司;荧光RT-PCR试剂盒(SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit),购自Invitrogen公司;一步法反转录数字PCR反应预混液(RT-dPCR Kit),购自苏州思纳福医疗科技有限公司。
  鸡胚 9~11日龄SPF鸡胚,购自山东济南斯帕法斯家禽有限公司。
  引物、探针设计与筛选
  从GenBank上下载NDV F基因序列,采用MEGA 6进行序列比对分析,选取保守区域设计3套特异性引物和探针(表1),并通过荧光RT-PCR和RT-dPCR方法筛选出最佳引物探针组合。引物和探针由宝生物工程(大连)有限公司合成。

  病毒核酸提取
  按照核酸提取试剂盒说明书提取病毒核酸,立即用于RT-dPCR扩增,或置-80 ℃保存备用。
  RT-dPCR反应
  反应体系见表2。反应程序:50 ℃,15 min;95 ℃,3min;95℃ 30 s,58 ℃ 60 s,42个循环。升降温速率2 ℃/s。

  灵敏度试验
  将基因VI型NDV核酸进行10倍倍比稀释,分别取100、10-1、10-2、10-3、10-4稀释度样品进行RT-dPCR检测,每个浓度做3次重复检测,评价方法的灵敏度。
  特异性试验
  提取基因VI型、VII型、XII型NDV,H5、H7、H9亚型AIV,IBV,AILTV,FAdV病毒核酸,使用RT-dPCR方法进行检测,验证方法的特异性。
  重复性试验
  用建立的RT-dPCR方法对基因VI型NDV核酸进行检测,重复测定6次,计算标准差和变异系数,评价方法的重复性。
  临床样品检测
  用建立的RT-dPCR方法对临床采集的180份鸽口咽/泄殖腔拭子样品进行检测,并与病毒分离方法检测结果进行比较。
  结果
  引物探针筛选
  用设计的3组引物探针组合对基因VI型NDV核酸进行荧光RT-PCR扩增。结果(表3)显示,第3组引物探针扩增Ct值略低于前两组。用设计的3组引物探针进行RT-dPCR扩增,结果显示,3组引物探针均可有效扩增,故最终选择第3组引物探针用于RT-dPCR方法建立。

  灵敏度试验
  将基因VI型NDV核酸进行10倍倍比稀释(100~10-4)后进行RT-dPCR检测,每个浓度做3次重复,获得梯度稀释扩增图(图1)和标准曲线y = 1.021 x - 0.132(图2),R2= 0.993。结果说明,本方法具有较高扩增效率,且在1.97×100~1.30×104 copies/μL的检测范围内具有良好的线性关系,最低检测限为1.97 copies/μL。



  特异性试验
  用建立的RT-dPCR方法检测基因VI型、VII型、XII型NDV,H5、H7、H9亚型AIV,IBV,AILTV,FAdV等9种病毒核酸,仅有基因VI型NDV检测结果为阳性,其余病毒检测结果均为阴性(图3)。

  重复性试验
  取同1份基因VI型NDV核酸样品,经RT-dPCR重复测定6次。结果(表4)显示,变异系数为2.2%,表明本方法重复性好,结果稳定、可靠。

  临床样品检测
  用建立的RT-dPCR方法对临床采集的180份鸽口咽/泄殖腔拭子样品进行检测,结果检出阳性样品14份,同时对180份样品进行病毒分离鉴定(鸡胚接种、RT-PCR扩增和测序、序列分析),结果显示14份阳性样品均为基因VI型NDV。RT-dPCR检测结果与病毒分离鉴定结果完全一致,符合率为100%,说明本研究建立的RT-dPCR方法可信度高,可用于临床样品中基因VI型NDV的检测。
  讨论
  基因VI型NDV是引发鸽ND的主要病原,严重危害我国鸽业健康发展。自20世纪80年代鸽ND传入我国以来,一直在我国鸽群中流行和传播。ND与禽流感、传染性支气管炎、传染性喉气管炎等禽类呼吸道疾病在鉴别诊断上难以区分,甚至一些APMV-13和APMV-7等副黏病毒也能与NDV发生HI交叉反应,因此快速鉴定NDV对于养禽业意义重大。ND的早期诊断主要通过血清学方法,如血凝抑制试验、病毒中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组化法(IHC)等,这些检测技术虽然能检测NDV但是不能判断其基因型和病毒毒力,而且有些毒株无法被ELISA等技术检测到。RT-PCR、荧光RT-PCR、环介导等温扩增技术(LAMP)等分子生物学方法是目前应用最广泛的方法。RT-PCR和荧光RT-PCR虽然能快速准确检测NDV,但其灵敏度和准确度还有待提高,而且经常会出现假阳性结果,也无法检测到所有NDV。LAMP需要针对模板设计4对引物,方法的建立难度较大,LAMP多路复用也增加了该方法的局限性,而且,上述方法均不能对病原进行绝对定量。
  随着科技的不断发展,1999年Bert Vogelstein和Kenneth W.Kinzler建立了第三代PCR技术,即dPCR技术。dPCR与第一代和第二代PCR技术相比,具有更高的灵敏度、精确度、耐受性以及绝对定量等优点,弥补了荧光PCR依靠Ct值间接定量的缺陷,也解决了荧光PCR重复性差的问题。dPCR可用于稀有突变检测、拷贝数变异分析、复杂样本基因表达检测等。近年来,在动物疫病检测中的应用越来越广泛,陈亚娜等和谭建锡等分别利用dPCR技术建立了伪狂犬病毒和H1亚型猪流感病毒微滴式dPCR检测方法,提高了检测的灵敏性和准确度。但由于其检测高浓度核酸样品时,无法实现精准定量,目前dPCR还不能完全取代荧光PCR。
  本研究利用dPCR技术,针对基因VI型NDV F基因保守区域设计特异性引物和探针,建立了一种可快速、特异、灵敏检测基因VI型NDV的RT-dPCR方法,可用于临床上鸽NDV的精准检测及样本中病毒核酸的精确定量,为研制诊断用核酸标准物质奠定了基础。

文章来源:中国动物检疫     文章作者:王静静等     文章编辑:一米优讯     
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