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陈雪娇，钟海安，张 博，凌 遥，张 浩，吴常信
（中国农业大学动物科学技术学院，高原畜禽遗传资源研究中心，北京 100193）
摘 要：藏鸡是世居在我国青藏高原地区的小型地方鸡种，对高原极端环境具有独特的适应性。藏鸡的低氧适应性表现在低氧孵化胚胎期死亡率低，胚胎心脏和尿囊绒毛膜（CAM）低氧条件下能维持正常的发育和功能。研究通过比较低氧孵化时藏鸡与低地鸡种的胚胎心脏和 CAM 组织基因表达，已经鉴定了一系列参与心肺系统发育、血管生成等途径的重要候选基因，但未能清楚阐明藏鸡胚胎适应低氧的分子进化机制，还需要进一步解析关键功能基因的功能及其机制。本文从生理表型、基因组选择和基因表达调控等方面回顾了藏鸡高原低氧适应性微进化机制研究进展，为藏鸡资源创新利用和优质高效新品种培育提供基础。
1 藏鸡高原低氧适应表型微进化机制研究
高原低氧会启动动物一系列生理适应性反应，包括红细胞生成增加、新血管形成、细胞能量代谢模式改变，以满足体内氧和能量平衡。虽然红细胞增加能改善氧气输送能力，但过量的红细胞增多会导致血液黏稠度和血管阻力增加，阻碍组织获得氧气。高原人群中，获得了最佳高原适应性的藏族人不是通过增加红细胞和血红蛋白（Hb）含量来适应高原的，其动脉血氧饱和度（SaO2）高；安第斯人动脉SaO2 低，Hb浓度高；而埃塞俄比亚人Hb正常，动脉SaO2 也正常。可见，高原适应性强的本土动物和人能钝化低氧诱导的红细胞增加、血管增生反应，调节血压和血流，维持血液循环系统的结构和功能，使机体达到新的氧平衡，适应低氧环境。
藏鸡具有鸟类的双重呼吸方式，1次呼吸活动，肺内发生2次气体交换，与哺乳动物相比，藏鸡的氧气交换能力更强。但鸟类胚胎是在体外发育，胚胎期是对低氧条件敏感阶段。有研究通过大量人工孵化和饲养试验证明了引入高海拔的低地鸡种对高原环境应激反应敏感阶段是胚胎期，藏鸡低氧适应的关键时期是胚胎期。藏鸡的蛋壳通透性低，孵化期间种蛋失水率低于低地鸡种蛋。虽然低氧孵化条件对鸡胚发育均有影响，但低地鸡种胚胎发育迟缓，发育期胚胎相对重量显著低于藏鸡，并出现大量死亡。通过解剖不同低氧水平孵化条件下的鸡胚胎发现，心脏和尿囊绒毛膜（CAM）受低氧刺激时，与其他器官异速发育，是低氧反应和低氧适应反应的关键器官。低氧孵化的藏鸡心脏发育正常，但低地鸡种心脏发育不良，心室壁变薄，心室容积增大，泵血功能不足。鸡胚胎CAM是其呼吸器官，表面密布血管，通过扩散方式实现血液与外界环境的气体交换，与哺乳动物的肺功能类似。低氧能代偿性地促进血管生成，低氧孵化的低地鸡种胚胎CAM中血管密度指数（VDI）增加，甚至出现畸形弯曲；但藏鸡胚胎低氧反应钝化，形成正常的血管网（图1），有利于血流动和气体交换。
2 藏鸡高原低氧适应基因组微进化机制研究
高海拔环境适应复杂生理的系统进化通常要求多基因互作的协调进化。利用全基因组变异信息在高原人和本土动物中鉴定了EPAS1、EGLN1和PPARα等受高原环境正选择的基因。在不同的适应群体和不同的物种中鉴定的受选择基因及其作用途径存在差异，说明面对同样的高原环境，不同的适应性进化事件会发生在不同基因上。藏鸡分布范围大，且高山峡谷相隔，包含多个类群，各类群间表型和基因型变异较大。Wang等采用基于重测序的基因组变异发现来自西藏的10只藏鸡分成2个独立的群体，而且2个群体不存在基因交流，群体正选择信号区域也不同。Zhang等分析了来自西藏林芝、拉萨和云南迪庆的藏鸡基因组变异信息，发现西藏林芝和拉萨的藏鸡聚为一簇，云南迪庆的尼西藏鸡则与云南的茶花鸡聚为一簇（图2）。这些结果说明不同区域的高原藏鸡迁移和适应性选择途径不同，适应性微进化机制也可能存在差异。
Wang等采用二代测序技术组装了藏鸡基因组，发现基因组序列嗅觉受体基因数量减少。此现象虽然在高原地山雀和藏猪基因组也曾报道，但并不能说明嗅觉受体基因家族的收缩在高原适应性上发挥重要作用。群体基因组选择分析发现，Ca2+信号途径中的几个候选基因可能在藏鸡中经历了直接选择，对高原适应性具有作用。Zhang 等分析高原鸡群体（包括西藏藏鸡、云南藏鸡和雪域白鸡）基因组选择信号，发现正选择基因与心肺血管和呼吸系统发育、DNA修复和免疫反应等相关，尤其是发生错义突变选择信号的基因涉及心肌发育、血管生成和血液循环等功能途径。Liu等比较了71个藏鸡个体和113个低海拔鸡种个体基因组变异信息，通过选择信号分析鉴定了HIF1AN、PDK1、ARNR2、NOS2等高原适应性相关基因。这些结果均表明与呼吸相关的基因选择是藏鸡能适应高原低氧环境的重要因素。
3 藏鸡高原低氧适应基因表达与调控
胚胎心脏是藏鸡适应低氧的关键器官。高原选择信号分析发现正选择基因涉及心脏发育和功能，因此分析藏鸡胚胎心肌组织的基因表达图谱，有可能鉴定到调节低氧适应的功能基因和调控途径。Zhang等采用RNA-seq 技术对低氧孵化16 d的鸡胚胎心肌组织进行基因表达谱分析，鉴定出藏鸡与低地鸡种差异表达基因主要为FGFR1、CTGF、ADAM9、JPH2、SATB1、BMP4和HYAL1等参与心肺系统发育的候选基因。Zhang等采用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术对藏鸡和茶花鸡在低氧和常氧条件下的胚胎心脏组织进行了蛋白质组学研究，鉴定了4 210个阳性表达蛋白，通过组间比较认为 ENLN1、ADAM9、MAP2K2、MYLK、NOTCH2和ANP等蛋白参与谷胱甘肽代谢、PPAR 信号通路、血管平滑肌收缩等信号通路，为藏鸡胚胎低氧适应重要候选基因。
胚胎CAM 也是藏鸡适应低氧的关键器官组织。基因组选择信号分析发现正选择基因参与血管生成、呼吸系统发育等途径。Zhang等采用RNA-Seq 和iTRAQ 技术对低氧培养下藏鸡和茶花鸡胚胎 CAM 组织进行转录组和蛋白质组分析，获得的差异表达基因和蛋白主要富集于血管生成、血管系统发育、血管形态发生、血液循环、肾素-血管紧张素系统、HIF-1和VEGF信号通路；其中HSPB1和HK2 F在藏鸡中表达高于茶花鸡，可以通过HIF-1和VEGF 信号途径调节CAM上血管生成和血管收缩扩张，维持藏鸡CAM血管系统结构和功能稳定性，从而适应低氧环境（图3）。
4 藏鸡高原低氧适应表观遗传微进化机制
动物进入新的环境中，基因组变异会受到选择，还会通过表观遗传修饰改变来调节基因表达，适应新环境。表观遗传修饰与 HIFs 共同调控低氧适应基因，尤其在低氧适应途径启动后，表观遗传调控对维持细胞长期低氧适应起到更为重要的作用。Zhang等采用甲基化 DNA 免疫沉淀高通量测序技术（MeDIP-seq）获得了低氧孵化胚胎心脏组织DNA 甲基化组图谱，鉴定了藏鸡和茶花鸡之间差异甲基化基因695个，主要参与血管平滑肌收缩、VEGF信号通路、钙信号通路等缺氧相关通路；其中BMPR1B、BMPRII、ITGA2、EDNRA和ENDRB2在藏鸡胚胎中低甲基化，可以通过上调基因表达，对低氧适应发挥重要作用。
低氧诱导因子1（HIF-1）是动物机体平衡氧稳态和调节低氧反应的核心转录因子，它与靶基因DNA序列结合，启动一系列基因表达，改善氧供应，以恢复氧平衡，使细胞、组织和机体在低氧条件下存活和生长。Zhang等采用染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）技术检测低氧孵化条件下鸡胚胎CAM组织HIF-1α靶向结合区域，并通过茶花鸡和藏鸡的比较，鉴定低氧藏鸡胚胎特异的HIF-1靶基因，结果发现HIF-1靶基因涉及血管生成、血液循环、mTOR 信号通路、MAPK信号通路、血管平滑肌收缩等功能，并提出PTK2、GPNMB、CALD1、CBWD1、SLC25A1、SPRY2、NUPL2和ST8SIA3等8个HIF-1靶基因在低氧适应中发挥重要作用。
非编码RNA通过与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种细胞活动。长链非编码 RNA（lncRNAs）和microRNAs（miRNAs）在高海拔动物的低氧适应调控中发挥作用。有研究表明，miR-17-92能直接靶向HIF-1α，在癌细胞增殖中发挥作用。lncRNA与Ezh2的协同作用能抑制HIF-1α的转录从而抑制癌细胞对组织缺氧的适应。Zhang等采用全转录测序技术测定了低氧孵化的藏鸡和茶花鸡胚胎CAM组织mRNA、lncRNA和miRNA表达谱，发现差异表达的几种RNAs主要参与血管生成（包括血管发育和血液循环）和能量代谢（包括葡萄糖、碳水化合物和脂质代谢），并构建竞争性吸附调控网络，提出了非编码 RNA 参与藏鸡胚胎低氧适应的调控途径（图4）。
5 藏鸡低氧适应性进化功能基因研究
藏鸡胚胎适应低氧条件涉及多途径和多基因调控（图5），为适应高原低氧环境，一些与之相关的基因发生突变，向着更有利于生存的方向进化。例如，藏鸡的血红蛋白珠蛋白α-D链上1个错义突变，可以提高血红蛋白氧亲和力，改善血液携氧能力。低氧孵化的藏鸡iNOS和eNOS基因表达量高于对照鸡品种，酶活力增强，NO合成增加，起到舒张血管、促进血液流动的作用。血红素加氧酶1（HO-1）是血红素分解代谢的限速酶，在缺氧条件下起着重要的细胞保护作用。低氧孵化的藏鸡胚胎HO-1表达量较高，调节低氧条件下的心脏发育和功能。这些基因可能在某些功能途径中发挥着作用，但藏鸡低氧适应的关键功能基因及其分子遗传机制尚不清楚。
6 结 语
藏鸡高原低氧适应是一个多基因、多途径、多器官参与的复杂进化机制，低氧环境对基因组中功能变异位点进行选择，同时也改变基因组表观遗传修饰，从而影响 HIF-1 启动下游靶基因表达；在非编码RNA参与调控下，基因表达的改变调节藏鸡CAM和心脏发育，从血管生成、血液流动和能量代谢等途径适应低氧条件，达到低氧条件下的氧平衡和能量平衡。但目前仍未能清楚阐明藏鸡胚胎适应低氧条件的分子进化机制，还需要进一步从适应性表型精准鉴定、基因调控和表观遗传修饰上深入研究，鉴定和验证藏鸡高原适应性的关键功能基因和调控位点，为藏鸡资源保存和创新利用、培育适应高原环境的优质高效鸡品种提供基础。
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