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摘 要：
2018～2021年间，山东部分地区的商品肉鸡等陆续发生了278例传染性喉气管炎（InfectiousLaryngotracheitis,ILT）疑似病例。经实验室PCR检测和病原分离鉴定，初步确诊为传染性喉气管炎病毒（InfectiousLaryngotracheitisvirus,ILTV）。利用SPF鸡胚，进行绒毛尿囊膜接种，结果分离到23株ILTV。选取10株ILTV毒株，对其结构蛋白gB基因进行了测序，比较了其核苷酸同源性，绘制了系统发育树，揭示了ILTV分离株及其与疫苗株的关系。此外，本文还分析了疫苗免疫在防控过程中所起的关键作用，对于如何预防和控制ILT具有重要的指导意义。
关键词：传染性喉气管炎病毒;流行;分离鉴定;控制;传染性喉气管炎（Infectious Laryngotracheitis,ILT）是由传染性喉气管炎病毒（Infectious Laryngotracheitis Virus,ILTV）引起鸡的一种急性、高度接触性传染病，主要侵害鸡上呼吸道，同时对眼睛、鼻窦、气囊和肺等组织产生影响。典型症状为呼吸困难、气喘，咳出带血分泌物、眼结膜炎和眼帘肿胀等。剖检可见喉部和气管黏膜肿胀、出血等，严重的病例则具有较高的致死性，死亡率可高达40%以上。除了ILT的典型症状外，ILT还可以表现为温和型，表现为黏液性气管炎、鼻炎、眼结膜炎、眼流泪等轻微症状[1]。传统认为，该病大多数发生在成年鸡和产蛋鸡，雏鸡感染率较低。但是，近年来，1月龄内商品肉鸡发生ILT的病例不断攀升，呈现出新的发病和流行趋势[2,3]。
ILT是世界上第一个利用疫苗成功控制的家禽疫病，变异频率相对较低。尽管如此，ILTV属于DNA病毒，对外界抵抗力较强，蛋、种鸡等广泛的疫苗接种，使得ILTV野毒株普遍存在，通常每隔3～5年就流行一次[4,5]。
中国ILT最早发生在贵阳（1959）。自20世纪80年代以来，该病伴随着我国养鸡业的蓬勃发展，已逐渐成为我国重要的地方流行性疫病。过去ILT的发病主要是以已开产的蛋鸡和种鸡为主，雏鸡和育成鸡较少发生。但自2018年以来，该病在我国江苏、山东等地的商品肉鸡流行普遍[6]，造成了极其严重的经济损失。
1 材料和方法
1.1 发病背景
2018～2021年，山东临沂、潍坊、枣庄等地以及江苏连云港、徐州等地的规模化商品鸡场、蛋鸡场等陆续发生了一种以严重呼吸困难、咳血、气管黏膜出血和充血的鸡病。主要危害20～50日龄的白羽商品肉鸡和地方品种鸡，以30～35日龄居多。白羽肉鸡的发病较多，且多数未经免疫。鸡群一旦感染，则传播速度较快，感染率在80%以上，死亡率在5%～30%，严重的死亡率可高达45%，几乎无药可治，严重影响鸡群的生产和经济效益。
1.2 病料处理
剖检具有典型症状的发病鸡或死亡鸡，取其气管黏膜或刮取黏膜黏液作为病料。病料剪碎后按1:3的比例加入灭菌的PBS溶液，反复冻融3次后，离心取上清，然后加入青、链霉素(2 000 U/m L)置4℃冰箱过夜处理，-20℃保存备用。
1.3 主要试剂、材料和仪器
Simply P病毒DNA/RNA共提取试剂盒，购自杭州博日科技有限公司；DNA胶回收试剂盒，购自天根生物科技有限公司；2×Premix Taq、DL2000bp DNA Marker，购自宝生物（北京）有限公司；PCR仪，购自Thermo Fisher公司；9～10日龄SPF鸡胚由山东省农业科学院家禽研究所提供。
1.4 SPF鸡胚接种
将无菌检验合格的病料经绒毛尿囊膜（CAM）途径接种10日龄SPF鸡胚，每日照蛋，舍弃48 h内非特异性死亡鸡胚，观察至120 h，死亡胚和120 h活胚及时放置4℃冰箱并保存过夜。在生物安全柜内，观察CAM和鸡胚病变。同时将CAM剪碎研磨，加入PBS稀释，反复冻融3次，离心取上清，置-20℃保存备用。取少量样品提取核酸，进行ILTV鉴定。
1.5 病原核酸鉴定
以ILTV的ICP4基因为模板，设计ILTV的鉴定用引物，建立相应的反应条件[7]。
1.6 g B基因序列测定
参考Gen Bank中ILTV经典株的结构蛋白g B基因序列，利用Prime preimer 5.0软件设计引物，F:5’-TTCGTCTTCGCTTTCTTCTGCC-3’,R:5’-CGCGGTCCTGTATGCAATCC-3’，引物由华大基因合成。
按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取样品的DNA,-20℃保存备用。PCR反应体系为：2×Premix Taq 25μL，待检DNA模板2μL，上下游引物（10 mmol/L）各2μL，最后用RNA-free H2O补足反应体系至50μL。PCR扩增条件为：94℃预变性4 min；进入94℃变性35 s,58℃退火45 s,72℃延伸180 s，共进行33个循环；72℃延伸10 min,4℃结束反应。将PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，选取2 660 bp目的条带回收后，连接p MD18-T载体，转化DH5α，接种LB固体培养基培养16 h，挑取菌落进行PCR鉴定。将阳性菌落接种LB液体培养基增菌，送华大基因进行测序。
1.7 同源性比较和系统发育分析
从Gen Bank中选择国内外的ILTV代表毒株g B核苷酸序列，利用Lasergen 7.1和MEGA5.1软件，比较其核苷酸同源性，并采用邻接法（Neighbor-Joining）构建支原体的系统发育树，探讨不同ILTV分离株及其与疫苗株间的遗传距离和系统演化关系。
2 结果
2.1 临床概况
2.1.1 流行病学
山东省农业科学院家禽研究所禽病诊断中心的检测数据表明，鸡ILT在2018年以后呈现逐年增加趋势。2018年送检病例24例，2021年增加到103例。在送检的疑似ILT的278份病例中，ILT的PCR阳性检出率高达40%，如图1。
2.1.2 典型案例
自2018年10月以来，临床报导ILT的病例逐渐增多，先是地方品种鸡发病。随后，在2020年5月～2021年4月，商品肉鸡发生ILT达到高峰。表1显示的是2018～2021年间几次典型的ILT疫情发生概况。调查显示，首先发生ILT疫情的商品肉鸡主要集中在鲁南和江苏连云港等地，该地区蛋鸡和麻鸡饲养密度大，且大都曾经免疫过ILTV活疫苗。相反，同地域的大部分商品肉鸡当时免疫率较低。其中，2019年，鲁南地区喉痘疫苗（基因工程疫苗）的免疫率仅为30%;2020年免疫率为50%;2021年，免疫接种率攀升至90%。2021年7月后，该地区商品肉鸡的ILT发病率陆续降至冰点。2022年1～9月份，未见ILT发病病例。由此可见，疫苗免疫在ILT疫情的防控方面发挥了决定性作用。
2.2 病原分离
筛选25份不同地域、不同日龄的PCR检测ILTV阳性鸡群病料，按常规通过绒毛尿囊膜（CAM）途径接种SPF鸡胚。剖检鸡胚发现：有23份病料接种的SPF胚，其绒毛尿囊膜明显增厚，接种部位出现典型的痘斑；且接种鸡胚与SPF鸡胚对照组相比，鸡胚明显发育较小，部分鸡胚胚体出血，呈现出典型的ILT鸡胚病变。
2.3 PCR核酸鉴定
取发生病变的CAM进行处理，利用ILTV鉴定用引物PCR扩增其ICP4基因，结果有23份有病变的鸡胚分离物，其ILTV核酸PCR扩增呈阳性。相反，没有观察到病变的2份样品，其ILTV核酸检测为阴性选取10份ILTV核酸检测为阳性的样品进行凝胶电泳检测，结果如图2。PCR产物片段大小约为570 bp，结果符合预期。对PCR产物进行序列测定，SD.JQ2020等分离株ICP4基因与美国ILTV经典鸡胚疫苗株（CEO）、中国ILTV经典强毒王岗株（WG）和澳大利亚CL9毒株的同源性均为100%，证实SD.JQ2020等分离株为ILTV。
注：M:DL2000 DNA Marker;1～10:ILTV分离株；11:ILTV阳性对照；12:阴性对照。
2.4 序列同源性分析
对ILTV的结构蛋白g B基因的测序测定表明，其片段长度为2 652 bp。核苷酸同源性比较显示，SD.JQ2020等分离株之间g B基因同源性为99.7%～100%；与我国广泛使用的疫苗株K317株同源性为99.6%～100%，呈现出较高的同源性；与美国ILTV经典疫苗株CEO和TCO等同源性为99.6%～100%，也具有较高的同源性；与意大利、韩国等ILTV分离株同源性为99.6%～100%；与我国ILTV经典强毒王岗株（WG）及澳大利亚A20和VI-99等同源性为99.5%～99.8%；但与α疱疹病毒亚科马立克病毒属MDV(JF742597）的同源性仅为33.9%。
2.5 系统发育树
系统发育树（图3）表明，SD.JQ2020等分离毒株与ILTV CEO疫苗株、我国活疫苗K317株等处于同一分支，显示出较近的亲缘关系；而与我国ILTV经典强毒王岗株（WG）、4株澳大利亚ILTV分离株遗传距离较远，处在两个遗传演化关系相对较远的分支。这表明，目前商品肉鸡ILTV流行株与我国目前常用的ILTV疫苗株遗传关系相对较近。
注：分支点上的数字表示构建系统树时1000次计算形成该节点的百分比；标尺长度代表0.5的gB基因序列的进化差异；“●”表示为本试验分离到的ILTV毒株。
3 讨论
3.1
成功从可疑ILT病料中分离出23株ILTV病毒株，确证了本次发生在商品肉鸡、地方品种鸡和蛋鸡上的疫情为ILT。对ILTV的结构蛋白gB基因的核苷酸同源性比较显示，SD.JQ2020等分离株与我国目前在蛋鸡、种鸡和麻鸡等广泛使用的疫苗株K317株高度同源。这表明，此次疫情与临床大量使用ILTV疫苗免疫高度相关[8,9]。无独有偶，2008年美国商品肉鸡发生的ILT，也与CEO疫苗免疫高度相关[10,11]。
3.2
针对鲁南地区的ILT疫情溯源发现，此次ILT疫情的发生与鲁南和苏北地区家禽饲养模式密不可分。该地区蛋鸡、麻鸡饲养数量较大，且大都经过了ILTV活疫苗免疫。此外，鲁南地区在2018年以后，商品肉鸡经历了高速的发展期，从事养殖的肉鸡公司增多，新建立的鸡场饲养规模较大，配套的一条龙企业如屠宰加工企业也较多，进而导致整个鲁南地域家禽饲养密度较大，蛋鸡与肉鸡交互饲养，再加上蛋鸡粪便、垃圾等清理不及时，导致疫苗毒扩散。此外，值得反思的还有，非洲猪瘟带来的意外“肉鸡火爆”行情，让大多数养殖者被利润冲昏了头脑，盲目扩张，忽视了鸡场的生物安全建设和管理。
3.3
疫苗是控制ILT发生最重要的技术手段。ILTV弱毒活疫苗包括鸡胚来源疫苗（CEO）和组织来源疫苗（TCO），均属于中等毒力，存在一定的安全隐患[12]。在4～12周龄（育成鸡）免疫接种效果最佳。但一般不能对4周龄以下的雏鸡接种，以免造成伤害。在实际生产中，个别养殖者忽视上述常识，对18日龄商品肉鸡进行免疫接种，结果导致鸡群发病。比较而言，基因工程疫苗似乎更适合于商品肉鸡的免疫[13]。
常用的基因工程疫苗通常包括载体疫苗和重组疫苗。王云峰等（2001）利用鸡痘病毒（FPV）为载体，成功表达ILTV中国王岗株gB基因，通过动物试验表明该载体病毒无论对商品鸡还是SPF鸡的免疫保护均具有较高的保护性[14]。此外，国外有两个成熟的商业重组ILTV疫苗，在临床应用较广[15]：一是由CEVA公司生产（Biomune公司），其以FPV作为载体插入ILTV的gB和UL32基因，特点是见效快，适合于商品肉鸡；二是由Intervet公司生产，将ILTV的gI和gD基因克隆到火鸡疱疹病毒（HVT）基因[16]，特点是维持期长，适合于蛋种鸡。上述两种疫苗均适合于胚胎接种或1日龄雏鸡接种，安全系数较高。
3.4
经历了2020～2021年的ILT疫情后，不同的家禽饲养企业加大了针对ILTV疫苗的免疫[17]。以鲁南地区为例，至2021年6月份，90%以上的鲁南鸡场分别采用CEVA公司生产的喉痘疫苗进行了ILTV的疫苗接种。同时，各公司加大了各饲养厂区的生物安全管理[18]。具体表现在：一是强化疫苗接种；二是将鸡舍空舍时间延长10 d以上，重视空舍期间的卫生消毒；三是合理布局新鸡场，最大限度地规避与蛋鸡场、麻鸡场等不同鸡场的生物安全距离；四是加强了对外来车辆的管理，禁止外来车辆进入；五是加强了对鸡场粪便及其污染物的处理。通过以上综合措施的实施，2021年7月以后的ILT疫情大幅度减少。持续的跟踪检测显示，2021年10月～2022年9月，鲁南地区ILT的发病几乎为零，达到了理想的控制效果。
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