|
探讨育肥猪病原菌组的组成
唐彩琰 译 范美红 校 李 红 审
摘 要：本研究介绍了一种草药饲料添加剂的体外开发过程，该添加剂能够选择性抑制病原菌组(如产气荚膜梭菌或螺旋体)的增殖，从而使育肥猪在无抗生素的情况下健康无腹泻，且生产性能更好。体外研究表明，日粮中添加1 kg/t的草药饲料添加剂可抑制76％的猪场特异短螺旋体和73％产气荚膜梭菌分离株的生长，日粮中添加2 kg/t的草药饲料添加剂可成功抑制胞内劳森菌分离株(PHE/MN1-00株和963/93株)的生长。
关键词：病原菌组；草药饲料添加剂；育肥猪；抑制本研究介绍了一种草药饲料添加剂的体外开发过程，该添加剂可调节致猪腹泻的肠内病原菌组的增殖，如产气荚膜梭菌或螺旋体(如短螺旋体和胞内劳森菌)，从而获得健康、无腹泻的育肥期。在该添加剂的开发过程中，我们使用了从世界各地多家猪场分离的毒株，这也从侧面表明这些病原体在世界范围内流行。
草药饲料添加剂的功效已在4项不同的体内试验中得到证实。
腹泻是育肥猪肠道疾病的一种常见症状，由多种微生物引起，可用多种广谱抗生素治疗。在禁止使用抗生素作为预防肠道疾病的生长促进剂后，一些新的替代品正在市场推出。
最常见的肠道疾病——尽管通常被认为与产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)有关——实际上是由不同种类的短螺旋体(Brachyspira sp.)或胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis)引起的猪增生性肠病、猪痢疾和猪肠道螺旋体病。即使是在技术娴熟的专业研究机构(如中国佛山大学)，上述两种革兰阴性菌均很难在体外被检测、分离或生长。
上述微生物要么是兼性病原菌，要么是专性病原菌，也可能与其他可能会导致肠道疾病的病原菌一起，成为“病原菌组”的一部分。该疾病的出现需要不止一种厌氧病原菌。
病原菌组会影响正常微生物组改变，从而导致猪痢疾或猪增生性肠病等疾病。
猪痢疾是一种由特征明确的β-溶血性猪痢疾短螺旋体(Brachyspira hyodysenteriae)，或汉普森细螺旋体(Brachyspira hampsonii)和“新”发的Brachyspira suanatina引起的疾病，而猪增生性肠病的病原菌是一种专性细胞内寄生的病菌，即胞内劳森菌。
二代测序技术帮助我们深入了解猪粪便或肠腔中的微生物种群，这是指示肠道疾病状态的重要信息。
肠道微生物组中的大多数(＞90％)细菌来自厚壁菌门和拟杆菌门，而回肠中为变形菌门的细菌。
应激(温度变化、运输、猪混群等)、抗生素治疗或饲料成分改变等都可能造成肠道微生物组的变化。
本研究的目的是开发草药饲料添加剂，通过抑制育肥猪的致病菌组，而又通过多种作用模式支持正常微生物组生长，从而预防腹泻：要么影响致病菌组的生长，要么提供只能由有益肠道细菌利用的营养物质。
本研究重点关注影响以下致病菌组的生长：
●短螺旋体属，包括猪痢疾短螺旋体、汉普森细螺旋体、默多克氏螺旋体和Brachyspira suanatina；●产气荚膜梭菌；
●胞内劳森菌。
研究人员首先在体外条件下对所开发的草药饲料添加剂进行了评估。评估使用了多个短螺旋体和产气荚膜梭菌分离株，以及两个胞内劳森菌分离株等育肥猪腹泻常见的病原体。
试验所用分离株来自世界各地的猪场，从侧面表明这些病原菌在世界各地流行。
在确定了控制特定病原菌组成分的适当剂量并建立体外结果与田间剂量之间的相关性后，研究人员在不同猪场的不同位点进行了体内试验，以评估新型腹泻预防策略和病原菌组控制策略的普遍适用性。
1 材料与方法
1.1 体外试验
在开发饲料添加剂时，研究人员用Soxlet提取法提取几种草药成分：在室温下，用90 mL乙醇萃取10 g原料3 h，并在48孔微量滴定板中进行连续两倍稀释，对病原菌进行检测(数据未显示)。
采用统计试验设计，确定提取物的最佳组合，并在载体上烘干草药，开发不同的饲料添加剂初始组合。饲料添加剂在室温下用水萃取4 h，并以0.5～2.5 kg/t的饲料浓度剂量对不同靶病原体进行试验。
1.1.1 抗短螺旋体和产气荚膜梭菌的草药饲料添加剂体外剂量依赖性研究研究筛选了约50株不同的短螺旋体(包括猪痢疾短螺旋体、默多克氏螺旋体、汉普森细螺旋体、肠道螺旋体和其他未鉴定的猪痢疾分离株)，并以猪痢疾短螺旋体ATCC 27164为参考菌株。
这些分离株来自世界各地有痢疾困扰的猪场，表明该病原体在世界范围内发生。以产气荚膜梭菌为例，本研究从不同猪场筛选出35种分离株，同样以产气荚膜梭菌ATCC 13124为参考菌株。
1.1.2 抗胞内劳森菌的饲料添加剂的体外剂量依赖性研究胞内劳森菌的培养和传代极其复杂，目前只有少数实验室和研究机构能够处理该病原菌。本研究检测了胞内劳森菌PHE/MN1-00株和963/93株。
微孔板接种McCoy细胞，孵育24 h，然后将1×107个胞内劳森菌悬浮在含有不同浓度草药饲料添加剂提取物的溶液中。
将悬浮液接种于McCoy宿主细胞，孵育24 h，使用倒置显微镜观察每孔严重感染细胞(HIC)的百分比，进而评估胞内劳森菌的活力和生长情况。
1.2 体内试验
体内试验的目的是在体内条件下，测试开发的草药饲料添加剂预防腹泻的效果。本文共介绍了4家欧洲试验的结果。
所有试验均在正常卫生条件下，在饲养不同数量育肥猪的猪场进行。试验组猪日粮中不添加抗生素，仅添加开发的草药饲料添加剂 (1 kg/t)。表1详细说明了试验条件。
2 体外试验结果
图1和图2详细列出了所开发的草药饲料添加剂对多种病原菌组(如短螺旋体、产气荚膜梭菌和胞内劳森菌)抑制的情况。
结果表明，虽然所开发的草药饲料添加剂在抑制病原微生物的生长上存在个别差异，但在1 kg/t或小于1 kg/t的添加剂量下，76％的被测试短螺旋体和73％的被测试产气荚膜梭菌均被成功抑制，而胞内劳森菌的最佳使用浓度为2 kg/t。
3 体内试验结果
表2汇总了4家欧洲猪场试验的结果。使用该草药饲料添加剂后，试验猪生产性能明显改善。试验结束时，试验猪的终末体重、增重和平均日增重均显著提高。试验组育肥猪的饲料转化率也显著提高。
其中，1号、3号和4号猪场试验猪的终末体重分别提高了1.6％、3.9％和1.7％，1号、2号、3号和4号猪场试验猪的增重或平均日增重分别提高了2.5％、1.6％、6.1％和3.4％(表3)。
1号、2号、3号和4号猪场的饲料转化率分别提高了9.2％、6.3％、6.3％和4.6％。
收益计算表明，4家猪场中，与对照组相比，添加草药饲料添加剂组实现8.2～ 5.7欧元/头的利润增长(1号、2号、3号和4号猪场的运营成本利润分别为8.2欧元/头、5.7欧元/头、7.9欧元/头和6.4欧元/头，对照组的运营成本利润分别为7.3欧元/头、5.3欧元/头、7.2欧元/头和6.1欧元/头)，试验组比对照组提高了12.3％、7.6％、9.7％和4.9％。
4 结论
本研究通过选择性抑制病原菌组的增殖，研究一种草药饲料添加剂预防育肥猪腹泻的效果，及其对育肥猪生产性能的影响。体外研究表明，日粮中添加1 kg/t的草药饲料添加剂可抑制76％的猪场特异短螺旋体和73％产气荚膜梭菌分离株的生长，日粮中添加2 kg/t的草药饲料添加剂可成功抑制2株胞内劳森菌分离株的生长。
进行体内试验时，在没有添加任何抗生素的情况下，实现了育肥期无腹泻，同时，育肥猪的生产性能明显更好，这很可能是由于猪肠道的亚临床病原菌组增殖受到抑制。
研究表明，当前开发的草药饲料添加剂是一种可以有效预防育肥猪腹泻的天然解决方案，可以维持育肥猪肠道正常微生物组的正常组成，并消除肠道中的致病菌组。
因此，连续饲喂开发的草药饲料添加剂有助于预防猪育肥期的腹泻，维持肠道系统的微生物平衡，并实现常规无抗生素的健康动物生产。随着草药饲料添加剂的使用，抗生素可以保留使用于疾病治疗。
|
