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摘 要：
传染性法氏囊病是严重危害家禽业的疾病之一，由传染性法氏囊病病毒引起，目前呈全世界分布，其田间毒株流行情况也在不断变化。为了解目前国内传染性法氏囊病的最新流行情况，近期采集了一定数量不同类型鸡群的法氏囊组织用于PCR病原学监测，采样鸡群日龄主要集中于传染性法氏囊病高发的3～5周龄。监测结果表明不同类型鸡群都存在一定比例的传染性法氏囊病毒感染情况，包括经典毒株、超强毒株及变异株，且以新型变异株传染性法氏囊病毒感染为主，其与美国变异株在进化树上同属变异株，但与美国变异株不同，氨基酸序列一致性为96.81%～98.24%；序列分析识别了6处变异株特异性氨基酸位点，8处新型变异株特有位点，为后续传染性法氏囊病毒的防治提供了依据。
关键词：传染性法氏囊病;田间毒株;变异株;
传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）是一种主要危害雏鸡的烈性、高度接触性传染病，主要侵害鸡的淋巴组织法氏囊，雏鸡早期感染本病后会造成严重的免疫抑制，该病目前呈世界性分布，其田间毒株流行情况也在不断变化。引起该病的传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）为无囊膜的双股RNA病毒，基因组由A、B两个片段组成，其中B片段负责编码法氏囊病毒五种主要蛋白中的VP1蛋白，而A片段负责编码VP2、VP3、VP4及VP5蛋白，VP2蛋白负责诱导鸡产生中和性保护抗体。法氏囊病毒目前分为两个血清型，血清Ⅰ型对鸡致病，而血清Ⅱ型对鸡不致病。IBDV非常稳定，对大多数消毒剂例如乙醚、氯仿不敏感，在p H 12条件下病毒失活，但在p H 2时病毒不受影响，在污染的饲料、水及粪便中可以长期存活。IBDV难以灭活的特性是它能够在鸡群长期存在的主要原因，甚至经过消毒及清洗的鸡舍也是如此。目前防控IBD主要靠疫苗免疫，同时辅以良好的生物安全措施。为了解目前国内IBD的最新流行情况，近期采集了IBD高发的3～5周龄鸡群的法氏囊组织进行PCR病原学监测。
1 材料和方法
1.1 临床样品采集和处理
从2020年8月至2023年5月，采集了我国主要家禽养殖区域的白羽肉鸡、蛋鸡及黄羽肉鸡共计90个鸡群的480份法氏囊组织样品（表1），使用PBS(p H 7.2）制备10%组织匀浆（重量体积比），3 000 g、4℃离心10 min取上清待检。
1.2 病毒RNA提取、逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）和测序从组织匀浆上清中，使用磁珠法提取病毒总RNA。采用一步法RT-PCR(Invitrogen,Cat#12574026),PCR扩增产物为1 350 bp，覆盖IBDV VP2基因。
上游引物序列：5′-ATGGCGAACCTGCAAG ATCA-3′；下游引物序列：5′-TGGCCCGGATTATG TCTTTGA-3′。
一步法RT-PCR反应条件：c DNA合成和预变性1个循环：54℃c DNA合成30 min,94℃预变性2 min;PCR反应35个循环：94℃变性15 s,56℃退火30 s,68℃延伸120 s;68℃最终延伸10 min后4℃保持或进行后续实验。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，阳性PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行Sanger测序。
1.3 VP2基因序列与进化树分析
分析成功双向测通样品，使用Geneious prime软件中Geneious Alignment和Neighbor-joining默认参数分析和构建进化树。
2 结果
2.1 不同类型鸡群的IBDV病原阳性检出率
按照白羽肉鸡、蛋鸡及黄羽肉鸡等鸡群类型进行统计，其中白羽肉鸡及蛋鸡的法氏囊样品全部来自商品代鸡群；黄羽肉鸡既有来自商品代鸡群的样品，也包含父母代鸡群的法氏囊样品，检测结果如表2所示。不同类型鸡群都有IBDV野毒检出，阳性率为17.33%～41.46%。其中新型变异株在蛋鸡中检出阳性率最高，为39.02%。
2.2 不同省份IBDV病原阳性检出率
不同省份IBD野毒阳性检出率见表3。结果显示8个采样的省份检出野毒感染，集中在辽宁、河北、广西、山东等养殖省份，超强毒株的阳性率从1.99%至12%不等；而新型变异株仍然是主要的毒株类型，阳性率从18.67%至33.77%不等。。
2.3 不同免疫程序IBDV病原阳性检出率
按照不同的IBD免疫程序对结果进行了统计，如表4所示。不同的免疫程序都有野毒感染检出情况，新型变异株IBDV是感染率最高的毒株类型。具体来看：只使用IBD灭活疫苗的鸡群存在变异株感染的比例为28.75%，只使用载体疫苗的鸡群变异株感染的比例为25%，同时使用载体疫苗和活苗的鸡群未检测到变异株感染情况，而单独使用活疫苗的鸡群感染比例高达83.33%。
基于VP2核酸序列的遗传进化树关系见图1。监测结果反映，单独免疫任何一种类型的疫苗，都不能完全阻止IBDV野毒特别是新型变异株的感染。载体疫苗加上活疫苗的免疫鸡群未检测到野毒感染，可能是样品数量较少的缘故。
2.4 序列分析
63株双向测通的IBDV新型变异株序列分析显示其与超强株、经典株、减毒株、变异株的核苷酸一致性分别为91.76%～93.56%、93.48%～94.05%、92.90%～93.72%和93.97%～95.68%。虽然新型变异株与美国变异株E、E/Del属同一进化树分支，但明显区分为2个亚支。新型变异株可分为2个组，新型变异株组1和新型变异株组2，二者的核苷酸一致性为95.84%～99.9%。成功分型的变异株中，79.7%(59/74）为新型变异株组1，样品分别来自辽宁省、山东省、河北省和江苏省；新型变异株组2样品来自辽宁省和河北省。
新型变异株的氨基酸序列与美国变异株参考毒株一致性为96.81%～98.24%，与其他参考毒株的氨基酸一致性为93.63%～96.81%，与美国变异株有共同的特征性氨基酸位点为213N、222T、249K、279N、318D和323E。新型变异株特有的氨基酸位点为77D、221K、252I和254N。除了上述共有的特征性位点，新型变异株的2个组系也拥有独特的特征性位点，新型变异株组1特有氨基酸位点为359K，新型变异株组2特有氨基酸位点为73I、79S和187V。
3 讨论
2017年以后（包括2017年）已报道的关于IBDV流行趋势的文章数量不多，王秀云指出IBDV变异株在华东六省流行比较普遍[1]；广西大学韦平老师实验室发表的IBDV在广西流行趋势的文章指出超强株在广西仍然是主要流行毒株[2]，这与我们本次调研的结果一致。本次监测多数样品来源于临床无明显IBD发病症状的健康鸡群，少数来源于IBD发病鸡群，说明目前由强毒造成的典型法氏囊疾病在鸡群依然存在，而新型变异株的隐性感染更加普遍，新型变异株IBDV感染的鸡群往往观察不到明显的临床症状，且对生产成绩可能没有明显的影响，当然这也受到不同地区疾病压力、鸡舍环境条件等因素的综合影响，还需要田间大数据进一步验证。本次调查中分离到的新型变异株可以分为两个类群，亲缘关系较近，VP2核苷酸一致性为95.84%～99.9%，而它们与经典毒株、超强毒株及美国变异株等其他类型毒株有一定遗传距离。
IBDV变异株可能早已经存在自然界中，但是直到20世纪80年代中期才初次在美国被报道，2019年以来我国陆续报道了鸡传染性法氏囊病毒新型变异株致病的病例[3]。变异株可能的来源之一是免疫压力下病毒发生突变，另外的一种可能就是不同毒株之间的重组，例如不同活疫苗毒株使用后在田间发生的自然重组。伴随着IBDV毒株的不断演变，防控该病的疫苗也在不断的更新迭代，出现了从第一代的传统减毒活疫苗和灭活疫苗到第二代的抗原抗体复合物疫苗，再到第三代的以火鸡疱疹病毒（HVT）为载体插入法氏囊病毒VP2片段的载体疫苗。IBD疫苗选择的基本原则：首先是安全性，不应该对免疫鸡只的法氏囊造成损伤从而引起免疫抑制；其次是可以有效控制该病，并且免疫保护期长；再次是尽量避免向环境排毒造成环境污染；最后就是免疫操作的时机及便捷性[4]。鸡舍环境相对孵化场来讲更加复杂，在田间免疫IBD活疫苗经常发生一免疫鸡群就发病的现象，属于典型的免疫应激，因此在孵化场免疫IBD疫苗是防控该病的首选。据研究，IBDV变异株具有较强的突破雏鸡母源抗体的能力，因此可以在一周之内就感染雏鸡，这将造成严重的免疫抑制，也是目前需要重点关注的变异株感染鸡群带来的不利影响[5,6]。当前利用变异株制作亚单位油苗在实验室条件下取得不错的免疫保护效果，具体使用效果及可防控的田间野毒范围仍然还需要田间大数据的验证[7]。结合以往国内外的报道及我们的监测结果来看，目前国内鸡群IBDV超强毒株感染依然存在，而新型变异株已经成为当前感染鸡群的主要毒株。
[1]蒲兴,党海斌,陈露.当前我国鸡群传染性法氏囊病感染情况调查[J].家禽科学,2023,45(10):1-5.
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