猪支原体肺炎的诊断技术及其疾病防控中的应用

现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2023/11/27 8:51:16 关注：553 评论： 我要投稿

  猪支原体肺炎的诊断技术及其疾病防控中的应用牛中伟
  （法国诗华动物保健公司，北京 100102）

  猪呼吸道疾病综合征（PRDC）是当前影响猪场经济效益的主要疾病之一，猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪肺炎支原体（M.hyo）是三种主要致病原。某种程度上讲M.hyo是PRDC造成肺部损伤的核心。了解M.hyo的诊断与检测方法并科学合理地运用可指导PRDC的防控。对疫苗免疫效果的评估应注重对肺脏损伤的保护，结合实验室检测技术，综合各项数据指导实践生产。
  猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体（M.hyo）感染引起的一种慢性呼吸道疾病，以非持续性的干咳为主要表现，发病率高、死亡率低。因M.hyo感染造成的呼吸道黏膜屏障破坏及免疫抑制，猪群易与当地流行的其他呼吸道病原混合感染俗称地方流行性肺炎，广泛流行于世界各地的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）及猪流感病毒（SIV）等的参与又将疾病发展成为广为人知的PRDC，给世界养猪业带来巨大经济损失。
  PRDC是多病原混合感染造成复杂疾病的典型代表，以PRRSV、PCV2和M.hyo为主的多种病原以猪只呼吸道为主战场，与宿主免疫系统相互作用，并在猪群中循环传播、复制，是当前猪群健康管理的头号对手。众所周知，对PRRSV、PCV2等病毒性病原，没有有效的药物。M.hyo是一类没有细胞壁、大小介于病毒和细菌之间的微生物，需要自主代谢和复制，对大环内酯类药物敏感，但由于M.hyo黏附于呼吸道气管上皮黏膜表面，难以被药物有效杀灭，猪支原体肺炎的临床症状也会随着脉冲式用药反复发生。PCV2和M.hyo商品疫苗已经广泛使用并得到了认可。PRRSV复杂、多变，但疫苗的使用在降低感染猪只病毒血症方面的效果也获得了广泛认可。在生产实践中，面对PRDC的复杂局面，针对3种主要病原免疫效果的评价呈现出PCV2的免疫效果最被认可、M.hyo的免疫效果不明显以及PRRSV疫苗免疫效果喜忧参半甚至忧大于喜的情况。以M.hyo疫苗最为突出，自20世纪90年代在国内外推广上市以来，一直没有找到被临床一线人员广泛接受的、可重复性好的免疫评价方案。但在PRDC的防控中，某种程度上讲M.hyo的防控是核心，是降低肺部炎症损伤的基础。了解M.hyo作为单纯致病原和混合感染在疾病中的作用，科学合理使用各种检测技术指导疾病防控和疫苗免疫，将有助于解答PRDC防控中的疑惑。
  1  M.hyo的分离培养
  从发病猪群中分离培养病原是所有传染病诊断的黄金标准，猪支原体肺炎的诊断也不例外。因M.hyo生长营养要求高，早期的病原培养主要采用原代肺脏组织块进行，即使开发出人工培养基也需要添加无抗体的猪血清来提高效率，增加了操作难度和成本。菌种分离、接种成功后，在培养基中繁殖到可供检测评估的含量需要4～8周的时间，限制了该方法的临床使用。支原体属在环境和健康猪体中还存在大量不致病的猪絮状支原体和致关节炎等疾病的猪滑液支原体，在分离培养过程中，这些不相关支原体的存在会与M.hyo竞争营养，严重降低分离成功率。综上所述，传统的病原分离培养虽然是疾病诊断的黄金标准，但对于猪支原体肺炎的诊断而言，病原分离培养技术并不适合临床诊断用。对于耐药性研究、疫苗种毒选育和不同毒株致病机理等长期投入的研究是不可或缺的。生产实践中分离田间野毒株，加强后备母猪的驯化，在获得纯化的毒株后也更容易落实。
  2  PCR检测技术
  PCR检测技术是常用的微量、快速、灵敏度高、特异性强的病原检测方法。在针对M.hyo的检测中，为了区分同源性高的支原体属病原的干扰还可以设计巢式PCR检测，准确率更高。采样部位的选择对M.hyo阳性猪只的检测灵敏度也很重要，研究证实鼻拭子的检测准确率低于气管拭子，更低于气管支气管灌洗液的检测准确率。但后两者采样要求高，在一定程度上限制了这类方法的推广使用。PCR检测克服了病原分离培养的弊端，虽然成本偏高也不太适用于大规模检测评估，但在获取相对准确的流行病学数据方面更快更可靠。
  Pieters通过给易感猪只攻毒，采用PCR技术检测猪只气管M.hyo的带毒情况，跟踪攻毒猪只的排毒时间证实，所有攻毒猪只在攻毒94 d后PCR检测M.hyo的核酸100%阳性，攻毒214 d后猪只PCR检测阳性率下降为61%，攻毒254 d后所有猪只气管已经检测不到M.hyo核酸，这表明自然感染M.hyo野毒的猪只个体可维持带毒排毒至少254 d。继而跟踪监测与攻毒猪只混养的哨兵猪只的气管带毒情况，发现在感染后8～200 d的时间里，攻毒猪只都可以向体外排毒，感染其他易感猪只，这为生产过程中对后备猪群采取M.hyo的驯化并建立阴性猪群提供了理论依据。将引入的所有后备母猪人为暴露于M.hyo野毒阳性环境里，确认所有猪只感染后闭群管理，在分娩前254 d时间里保持不再接触其他毒株，分娩后便可以获得M.hyo阴性的仔猪。
  Giacomini通过跟踪PCR跟踪监测意大利66个牧场，不同生产模式下猪群M.hyo的气管拭子病原检测阳性率，发现猪群中M.hyo的感染状态主要受猪群猪只日龄和生产模式的影响。相同生产模式下日龄越大，猪气管拭子中M.hyo的核酸检出率越高；不同生产模式下，单点式生产比多点式生产的猪只气管拭子中M.hyo核酸的检出率高；而且单点式生产模式相比多点式生产更容易发生早期感染，病原的传播流行速度也相对更快。说明M.hyo在猪群中的传播主要依靠不同日龄猪只的接触和易感猪群间的水平传播进行。
  更多的研究则通过PCR检测技术调查区域内M.hyo的流行情况，如Pacce通过屠宰场内肺脏采样监测发现巴西国内M.hyo的检出率高达90%以上；而Vicente通过屠宰场血清阳性率调查得出数据只有52%。这也反映出PCR检测相对血清抗体检测而言有更高的准确性。
  M.hyo疫苗的免疫可以减轻感染引起的临床症状、降低疾病造成的经济损失，但不能阻止野毒继续感染，通过PCR检测野毒阳性率评估疫苗免疫的效果并不是一个好选择。
  以上两种病原检测法在疾病相关的调查中更有价值，但M.hyo的感染致病是病原侵袭和机体反侵袭、调用免疫系统应答，M.hyo致免疫细胞凋亡继而产生病变等一系列复杂的过程。在PRDC等呼吸道病原混合感染过程中，其他病毒、细菌等病原相互作用，疾病的进程更加变化多端。通过临床症状、剖检诊断、血清抗体监测及病理组织学检查可以从机体应答的层面得出，除了病原外的对疾病更直接关联的信息，来指导临床施治和评估施治方案的效果。
  3  临床症状和剖检诊断
  只由M.hyo感染引起的慢性呼吸道病以非连续性的干咳为主，猪只体温不会升高，引起的肺部病变在3个月左右可以自行吸收恢复，但通常会留有疤痕，死亡率不高。当猪只表现出发烧、腹式呼吸时则表示出现了继发或混合感染，地方流行性肺炎和呼吸道疾病综合征都可出现更严重的临床症状，最终导致高死亡率。剖检诊断通常针对死亡不久或濒死没有饲养价值的猪只，M.hyo感染造成的肺部病变很典型，病原感染引起的炎症反应及淋巴细胞的挤压、凋亡等会导致肺尖叶、心叶甚至膈叶出现对称性的肉样变，与正常肺组织界限明显，触摸无气胀感。临床症状和剖检诊断是疾病诊断的第一步，依据典型病变可以判定猪群在特定阶段存在M.hyo感染，但致死的主要原因还要结合其他病变的诊断和后续的检测进行确认。因小日龄猪只肺部病变还存在再吸收的可能，所以育肥猪和到屠宰上市猪只肺部肉样变更能反映猪群真实的支原体病变情况。
  剖检过程中肺部尖叶、心叶之间注意是否有纤维丝状粘连，即使没有看到典型肉样变，出现这类粘连表明支原体的早期感染，病变在积蓄形成中。对于保育猪只的临床剖检特别要留意这种现象。
  通过咳嗽、呼吸困难等症状评估疫苗免疫效果在现阶段国内复杂的临床现状下很难做到客观判断，除了猪舍条件、通风的影响外，PRRSV、PCV2、猪伪狂犬病毒（PRV）等的感染都会导致咳嗽等呼吸道症状。辅以药物治疗性诊断有一定的价值，通常病毒感染引起的临床症状无法通过添加药物快速消除。
  4  血清学诊断技术
  血清学诊断技术是一种比较好的针对群体采样、评估疾病感染及免疫应答效率的方法。
  目前在售的有多款对M.hyo的抗体检测试剂盒。但血清学诊断是基于体液免疫应答的抗原抗体反应，M.hyo感染定植在呼吸道，极少进入血液、淋巴循环系统，即使刺激机体产生了抗体，体液中的高水平抗体也无法接触到病原产生中和作用。所以ELISA检测试剂盒检测到的抗体水平无法反应疫苗免疫的保护效果。但作为未免疫猪群血清流行病学调查可以提供参考，其准确率低于PCR检测，但不失为一种成本低、数据量大的调查方法。
  M.hyo的基因组含有近700个开放阅读框，232毒株在体外培养时实际表达的蛋白约480种，由于毒株差异、疫苗培养工艺不同，M.hyo全菌灭活苗会存在抗原表达丰度的差异。以对M.hyo定植有重要作用的膜表面蛋白为例，目前已知的定植膜蛋白种类有35种，很难通过几种蛋白的组合免疫就能起到良好的免疫效果，全菌疫苗由于抗原表达丰度的差异也不一定面面俱到地刺激产生不同蛋白的抗体。生产实践中，通过同一种试剂盒检测不同M.hyo疫苗免疫4周后的抗体阳性率在30%～100%之间。寻找更加保守的蛋白靶标，通过灵敏度更高的ELISA方法可以缩小这种差异，为疫苗免疫效率评估提供指导。
  近期IDVet公司开发了一款基于P65蛋白的阻断ELISA试剂盒，在监测猪只血清抗体时表现出了良好的特异性和敏感度，通过对免疫后不同日龄抗体阳性率的监测以及相同日龄、不同血清稀释度抗体水平的测定，可以从质和量上对疫苗免疫应答的效率做出评估。这为M.hyo疫苗免疫效率的评估提供了一种周期短、可量化的指标。结合反应实际保护效果的屠宰场肺部病变评分可以更加客观地反应疫苗的免疫应答质量。
  5  组织病理、免疫组化检测
  可采用标记抗体对在气管、支气管等组织切片上的M.hyo病原进行检测，M.hyo很少造成致死性病变，临床诊断并不困难，生产实践中很少使用。
  在评估疑似PCV2造成病变时，需要结合组织病理学诊断技术进行确诊。现代养猪生产中，PCV2广泛存在，疫苗免疫猪群也经常能检测到PCV2血症。但确诊疾病是否由PCV2感染引起，组织病理学检测最具指导价值。同样都会引起猪群免疫抑制，PRRSV感染和PCV2感染引起的免疫抑制是截然不同的。在PCV2疫苗普遍免疫的情况下，断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）依然在一些猪场出现，很多情况下是PRRSV活跃引起。在评估PCV2疫苗及圆支二联疫苗免疫效果时需特别注意。
  6  屠宰场肺部病变评分
  屠宰场肺部病变评分是对正常屠宰上市猪只进行肺部病变评分，主要评估猪群M.hyo感染和传染性胸膜肺炎感染状况的方法，其中M.hyo感染引起的肺部病变评分有28分制、5分制、55分制、35分制等，其中以Madec 28分制操作简便、易于操作使用最为广泛。因屠宰上市的猪只数量大、支原体肺部病变特征明显，操作成本低且可以重复进行，是猪群呼吸道疾病调查和猪肺炎支原体疫苗评估必不可少的工具。前文提到的临床诊断和剖检仅针对少量发病猪，并不具有代表性。以屠宰场传染性胸膜肺炎病变比例为例，超过2%的肺脏有典型病变时，全群就需要采取治疗和免疫措施。对PRDC几种主要病原疫苗免疫效果的评估更需要落实到屠宰场进行肺部病变评估。单纯的免疫应答指标仅反映疾病发展中的一个暂时状态，免疫应答是否造成器质性损伤引发病变是一个级联反映的结果。Thacker发现PRRSV弱毒疫苗免疫能提升M.hyo疫苗的抗体，但在验证支原体攻毒保护时PRRSV疫苗的免疫却导致了M.hyo疫苗对肺部病变保护效果的下降。非洲猪瘟疫情过后，层出不穷的联合免疫方案应运而生，在评估联合免疫的可行性方案时，很多试验只关注了抗体应答指标，忽视了细胞免疫和机体炎症反应引起的实质病变评估。
  根据笔者的经验，虽然屠宰场肺部病变评分要求参与评判的猪只数量50头以上为宜，建议每批上市猪只尽量都进行评分。同一条屠宰线上，前面屠宰的猪只通常健康度好、肺部病变少，后半程的猪只健康度差、肺部病变严重，考虑到整群猪只的情况需要完整的加以评分记录。法国诗华开发出了基于Madec评分方法的小程序，手机、平板可视化操作，将后续数据统计和计算的工作交由计算机完成，极大节省了人力，而且形成完整的数据库进行纵向和横向的对比，指导生产实践。非常适合进行大群体的M.hyo疫苗、圆支二联疫苗等的免疫效果评估。
  某种程度上讲控制好M.hyo感染导致的疾病是PRDC防控的核心，普遍认为疫苗免疫是最为经济、高效的控制PCV2、M.hyo等“经济效益性”疾病的手段。实验室检测技术和临床诊断技术相结合，最终落实到上市群体的终极健康表现，通过屠宰场肺部病变评分指导生产实践和疫苗免疫，猪群的生产成绩会越来越好。