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母猪妊娠早期唾液、尿液和血浆
生殖激素变化规律及唾液结晶分析
任玉军 1，张庆泽 1，韩?飞 2，3，陆?勤 2，3，赵月麒 1，何?凡 1，黄?涛 1，3 *
（1.石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832000；2. 新疆天康畜牧科技有限公司，新疆 昌吉 831199；3. 新疆生猪种业工程技术研究中心，新疆 昌吉 831100）
传统的血液样本采集时易对母猪造成较大的应激，对于妊娠期母猪采集易造成胚胎损失，而在采集唾液和尿液时母猪处于主动状态，降低了应激对检测结果的影响。同时口腔分泌的唾液中含有多种矿物质和微量元素，有研究发现在人类孕期不同阶段唾液中氯离子的含量与血液中孕激素的含量呈负相关。前期有研究对水牛在卵泡破裂后采集唾液中雌二醇含量和雌二醇/孕酮的比率均显著高于发情期和休情期。对贵州香猪和版纳微型猪妊娠早期外周血孕酮含量进行测定，发现在母猪妊娠第16天与发情期孕酮含量差异极显著。另有研究表明，水牛发情期唾液结晶会表现出多种植物模式，推测是由于雌激素浓度变化导致唾液中电解质含量发生变化，且发现唾液结晶变化与雌激素水平呈强相关。当前，已在多种动物不同生理阶段利用唾液结晶进行了判定，并取得理想效果。但目前仍然主要使用血液来源的样本对猪进行相关检查，因此，对母猪唾液生殖激素浓度进行测定，并对唾液结晶进行分析对研究母猪生殖生理具有重要意义。
本试验通过对母猪早期妊娠阶段唾液、尿液和血浆中激素含量变化规律与唾液结晶形态分析，初步评估利用唾液建立一种非侵入性采样和样本检查一体化方法可行性，并利用对唾液、尿液与血浆中生殖激素检测结果进行比较，评估唾液结果的准确性，为实现无创和非侵入性的母猪妊娠诊断方法提供理论基础。
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材料与方法
INTRODUCE
1.1试验动物
本研究对象为8头二元母猪，每个时间点采集相同批次标记母猪。试验母猪均来自新疆玛纳斯某国家级生猪产能调控基地，所有母猪胎次为3～5胎，无生殖系统疾病。配种舍内温度保持在18～25℃，湿度保持在50%～55%，生产采用全进全出制，饲喂全价配合饲粮，并按规定进行免疫和日常管理工作。
1.2 试验动物处理
母猪断奶后每天上午10：00和下午16：00利用公猪诱情并进行发情鉴定，根据母猪静立反应判断其是否发情，并在发情当天进行人工授精，记为妊娠第0天，连续人工授精 3次。人工授精后第18天使用公猪诱情查看母猪是否返情。人工授精后第25天和第35天使用兽用B超仪对母猪进行妊娠鉴定，两次均判定为阳性则认为妊娠，且在后期追踪过程中标记母猪均正常产仔，一次为阴性或两次均为阴性母猪未计入测定群体。
1.3 主要仪器设备与耗材
高速离心机、移液枪、全波长微孔板分光光度计、液氮罐，赛默飞世尔科技（中国）有限公司产品；5 mL冻存管、2 mL冻存管，广州洁特生物（中国）有限公司产品；无菌脱脂纱布，康民医疗器械（中国）有限公司产品。
1.4 样品收集
1.4.1 唾液采集及处理
收集8头母猪妊娠第0天，第10天，第12天，第15天，第18天，第20天和第40天唾液（如图1）。采集时间为早上饲喂前，唾液采集时母猪处于站立状态，使用脱脂无菌纱布吸引母猪进行咀嚼，待对纱布充分咀嚼后，借助自封袋将纱布中的唾液挤入高温高压处理后的离心管中（如图2），3 000 r/min离心10 min，取上清转移至5 mL冻存管并在液氮中保存，带回实验室后放于-80℃保存备用。
图1 唾液采集
图2 采集离心后唾液
1.4.2 尿液采集及处理
收集8头母猪妊娠第0天，第10天，第12天，第15天，第18天，第20天和第40天尿液。早上饲喂前采集尿液，并将采集尿液转移至5 mL冻存管中放入液氮保存，带回实验室后放于-80℃保存备用。
1.4.3 血浆采集及处理
采集血液对妊娠母猪易造成应激导致胚胎损失，因此仅收集6头母猪在妊娠第12天、第15天、第18天血浆。早上饲喂前，利用保定器固定母猪，使用含EDTA储血管在母猪前腔静脉采集血液，上下混匀，1 500 r/min离心15 min，取上清液转移至2 mL冻存管并在液氮中保存，带回实验室后放-80℃保存备用。
1.5 激素测定
试验对母猪唾液、尿液和血浆中生殖激素利用猪雌二醇ELISA检测试剂盒、猪孕酮ELISA检查试剂盒测定浓度。试验流程按照试剂盒（购自上海恒远生物科技有限公司）说明进行操作。
1.6 唾液结晶制作
唾液3 000×g 10 min处理，将上清液转移到新的离心管中，取20 μL唾液滴在干净的玻片上进行涂片制作，操作时避免气泡的产生，之后将唾液涂片在室温放置15～20 min晾干，并在倒置显微镜下使用200×物镜观察唾液结晶情况。
1.7 统计分析
利用Excel对所得数据进行初步整理，使用统计软件SPSS 22.0分析数据，对不同周期母猪唾液、尿液和血浆生殖激素浓度变化及唾液结晶分维值进行描述性统计。利用Pearson进行相关性分析，P＜0.05认为具有统计学意义。使用Fractalyse 2.4（http://fractlvse.org）对母猪早期妊娠各阶段的唾液结晶几何分维值进行分析。
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结果
INTRODUCE
2.1 母猪早期妊娠唾液、尿液和血浆中生殖激素浓度变化2.1.1 雌二醇浓度的变化
由表1可知，唾液雌二醇浓度变化与尿液雌二醇浓度的变化趋势基本一致。唾液雌二醇浓度值在第10天最高，为250.47±12.30 pmol/L，第20天时最低，为198.71±11.34 pmol/L。尿液雌二醇浓度在妊娠后第18天时达到最大，为258.21±10.39 pmol/L，第15天时最小，为222.23±14.89 pmol/L。
血浆雌二醇在妊娠第12天、第15天和第18天浓度均低于唾液和尿液，变化趋势与唾液和尿液一致。对母猪唾液和尿液中雌二醇进行相关性分析，发现唾液和尿液中雌二醇浓度呈正相关（R2=0.497，P＜0.05）。
2.1.2 孕酮浓度的变化
由表2可以看出，母猪早期妊娠唾液和尿液中孕酮浓度的变化趋势一致，且唾液中孕酮浓度在各个阶段始终大于尿液中孕酮浓度。唾液孕酮浓度在第0天时达到最大值为3 125±154.44 pmol/L，在第20天时浓度最低为2 649.06±173.96 pmol/L，第20天后孕酮浓度开始上升。尿液孕酮浓度在第0天时达到最大值为2 729.51±99.64 pmol/L，在第20天时浓度最低为1 798.14±148.29 pmol/L，第20天后孕酮浓度开始上升。血浆孕酮在妊娠第12天、第15天和第18天浓度低于唾液浓度，变化趋势与唾液和尿液相似。对母猪唾液和尿液中孕酮浓度进行相关性分析，发现唾液和尿液中孕酮浓度呈正相关（R2=0.826，P＜0.01）。
2.2 母猪早期妊娠不同阶段唾液结晶形状的判定母猪妊娠不同阶段唾液会形成不同的结晶形状，图3为母猪妊娠第0天至第40天不同阶段的唾液结晶图，从唾液结晶图形中可以观察到第0天、第20天树枝状结晶模型、第10天密集松针型结晶模型，第12天松针型结晶模型，第15天、第18天为典型蕨根类植物模型，第40天为树枝状结晶模型与蕨根类植物模型混合型。
图3 母猪早期妊娠不同阶段唾液结晶图型（200×）
2.3 母猪早期妊娠不同阶段唾液结晶分维值
为进一步说明唾液结晶在母猪妊娠期变化趋势，对母猪早期妊娠不同阶段唾液结晶进行分维几何值分析，结果如图4。P0、P10、P12、P15、P18、P20、P40唾液结晶分维值分别为1.787、1.56、1.589、1.474、1.908、1.957、1.912，第15天分维值最低。此外分析发现唾液结晶分维值与唾液中雌二醇含量呈负相关（R2=-0.677，P＜0.05）。
图4 母猪早期妊娠不同阶段唾液结晶分维值
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讨论
INTRODUCE
在医学临床中生殖激素水平检测通常在血清和血浆中进行，从而实现准确反映人体生理变化的目的。而在母猪管理过程中同样沿用外周血测定相关激素浓度，目前主流采血方法为前腔静脉采血，容易对母猪造成较大应激导致测定结果不准确。尿液采集相对血液避免了猪产生应激反应。目前多项研究表明可利用猪尿液检测药物残留和开发生物标志物。而利用尿液检测未普及主要是因为尿液采集受母猪生理节律、饮水量等的影响，无法实现即时收集。El-Farhan N等研究认为唾液中游离激素是由血液中类固醇激素超滤转运而来，可用唾液代替血液进行激素测定。母猪在胚胎附植期需要安静饲养来保证受胎率和产仔数，不适宜被动采血造成应激导致胚胎损失。因此从母猪养殖福利和保证生产水平考虑，使用唾液对母猪生殖激素监测是可行并且更加适用的。
王月莺对大白猪早期妊娠阶段的外周血清的雌二醇和孕酮浓度进行检测，发现雌二醇和孕酮在母猪胚胎附植期生殖激素浓度出现下降趋势，在第15天时浓度最低。侯斌对妊娠不同天数大白母猪和梅山母猪血清中的雌二醇和孕酮含量测定，检测出雌二醇浓度和孕酮浓度在第15天时最低，之后浓度逐渐上升，这与本研究结果一致，同时在本研究中利用唾液和尿液对相同时期雌二醇和孕酮浓度测定结果高于利用血浆的测定值，唾液中孕酮浓度范围在2 600～3 100 pmol/L之间，雌二醇浓度在190～250 pmol/L之间。国外也有报道，唾液中的雌二醇水平高于血液中的雌二醇水平。与此同时，对母猪唾液和尿液中雌二醇与孕酮进行相关性分析，发现唾液和尿液中的生殖激素浓度呈正相关。在本研究中，期望通过对妊娠母猪的探究，寻找利用唾液和尿液进行生理状态监测的可行性。
目前利用唾液结晶进行发情鉴定已在犬和水牛等多种动物上进行了应用，此外还有研究表明可以通过唾液电解质检测女性排卵情况。这些研究对实现母猪利用唾液进行非侵入性诊断具有重要参考意义。与此同时，Ravinder R研究发现唾液结晶变化与雌激素的变化趋势相似，这与本试验结果体现一致。但由于受采集方法和动物习性等方面的影响，目前利用唾液结晶判定动物生理状态仍需进一步探究和验证。除对家养动物和已驯化动物进行运用外，这种非侵入性方法对于濒危野生动物的保护也具有重要指导意义。当前利用唾液对家畜繁育的研究主要集中在水牛上，此外Li C等利用唾液蛋白组实现了对猪进行发情鉴定。Fletcher L等筛选唾液中代谢生物标志物，用于后备母猪产仔潜力的预测。Madsen P A等研究发现猪唾液代谢物中的脂氧化物可作为诊断胃溃疡的生物标志物。基于此，开展猪唾液组学对于提高养殖户管理水平和母猪繁育水平具有重要指导意义。本试验对母猪胚胎附植期唾液样本生理特性进行了分析，为母猪早期妊娠诊断提供了另一种思路，证明了其可行性，为开发一种便捷、安全、实惠的妊娠诊断方法奠定了研究基础。
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