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鸡源和兔源屎肠球菌的耐药性及相关基因分析


现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2024/3/7 8:54:54 关注:368 评论: 我要投稿

  2020年4月,山东省某鸽场及某兔场发生腹泻情况,发病率较高。试验从病鸽及病兔肝脏中各分离到一株革兰氏阳性球菌,通过16S rRNA测序鉴定均为屎肠球菌。两株分离菌均未检测到cylA、gelE、ace等8种毒力基因。药敏试验和耐药基因结果显示,两个菌株都对β-内酰胺类耐药,耐药基因检测结果也一致。这些结果提示屎肠球菌或许能引起鸽及兔感染,对鸽或兔的临床治疗及公共卫生学具有一定的参考意义。
  关键词:屎肠球菌;分离鉴定;耐药;毒力基因;
  屎肠球菌(Enterococcus faecium)属肠球菌属中的一类,是人及动物的肠道正常菌群之一[1,2],其代谢产物能够抑制肠系有害菌[3]、调节肠道菌群结构、改善生产性能等[4],常作为饲料添加剂在养殖生产中普遍应用[5];同时也是重要的人兽共患条件致病菌,可引起人及动物的感染等[6],且可通过污染的食物传播给人[7],在公共卫生学上具有重要意义,因此在生产中应严格筛选菌种。
  2020年4月,山东省某鸽场鸽子零星出现精神沉郁、水样腹泻,一周内死亡。同期,某兔场仔兔也发生腹泻情况。本研究以发病鸽和发病仔兔为研究对象,分别无菌采集肝脏进行分菌,通过纯化、16S r DNA测序、生化试验、药物敏感性试验等完成菌种鉴定,利用耐药基因检测分析分离菌的耐药性,为临床治疗及公共卫生提供参考。
  1 材料
  1.1 病料来源
  病料来源于发病鸽场与兔场。
  1.2 试剂
  2000 DNA Maker购自天根生化科技;p MD-18T克隆载体购自Ta Ka Ra公司;PCR扩增试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒均购自Axygen公司;细菌微量生化管购自北京陆桥技术股份有限公司;药敏纸片购自北京艾博利德商贸有限公司;甘油、1×TE缓冲液、细菌培养基及其他试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
  2 方法
  2.1 细菌分离纯化
  无菌条件下分别取病鸽及病兔肝脏,接种于5%胎牛血清培养基,37℃培养18~24 h,观察记录细菌生长状况及形态。挑取培养或纯化后的单菌落,涂片进行革兰氏染色,在光学显微镜下观察细菌形态及染色特性。
  2.2 生化试验
  参照伯杰氏手册,使用杭州滨和微生物试剂有限公司的细菌微量生化管,按使用说明书进行操作及结果判定。
  2.3 PCR鉴定
  16S r RNA基因片段通用引物,27F:5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3';1492R:5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3',由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。取单个细菌菌落悬浮于50μL生理盐水作为模板,按照如下比例配制反应体系:模板1μL,上下游引物(20 pmol/μL)各0.5μL,2×Taq PCR Mix 12.5μL,补充去离子水至25μL。反应条件为:95℃预变性5 min,95℃30 s,55℃1 min,72℃1min,共进行30个循环,最后72℃延伸10 min。将PCR产物克隆至p MD-18T载体,鉴定阳性质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司。
  2.4 药敏试验
  按照WHO推荐的琼脂纸片扩散法(K-B)对分离菌进行药敏检验,结果按NCCLS标准做出判定。
  2.5 耐药基因及毒力基因检测
  11种耐药基因[8][(Van A、Van B、qnr A、tet E、flo R、aac(6')-I、tet M、erm B、bla TEM、bla SHV、bla CTX-M)]和8种毒力基因(cyl A、gel E、ace、agg、esp、efa A、acm、fsr)引物序列参照文献[9,10]合成。扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序,测序结果与Gen Bank序列比对。
  3 结果与分析
  3.1 细菌分离情况
  从病鸽、病兔中各分离出1株细菌,分别命名为G0401、T0402,2株分离菌在有氧和微厌氧的条件下均可生长,37℃培养18~24 h,在血清板上呈现灰白色半透明、圆形微凸、表面光滑、湿润的小菌落,菌落大小在0.5~2.0 mm之间。1000×镜检为单个、成对或短链状的G+球菌。
  3.2 生化试验
  两株分离菌均能发酵木糖、蔗糖,均能水解精氨酸,不发酵山梨醇、甘露醇,不液化明胶,均符合肠球菌生化特性。
  3.3 16S r DNA的测序结果及同源性分析
  PCR扩增结果显示,两株分离菌扩增序列大小约为1500 bp的目的条带;鸽源、兔源分离株扩增序列测序后与NCBI公布的登录号为CP044264.1参考序列同源性分别达99.67%、99.74%,两株分离菌鉴定为屎肠球菌,见图1、图2。


  注:M:DL2000 DNA Marker;1:G0401 PCR产物;2:T0402 PCR产物;

  3:阴性对照。


  3.4 药敏试验结果见表1。
  两株分离菌对β-内酰胺类、林可霉素类、磺胺类、阿米卡星、多粘菌素、土霉素均为低敏,对新霉素均为中敏;鸽源分离株对恩诺沙星中敏,对氟苯尼考高敏,对强力霉素中敏;兔源分离株对恩诺沙星、氧氟沙星、左氟沙星、加替沙星高敏,对氟苯尼考中敏,对强力霉素低敏。


  3.5 耐药基因和毒力基因检测
  结果显示,在鸽源分离株及兔源分离株上均发现2个(erm B、bla TEM)抗生素抗性基因;然而8种毒力基因均未检测到。
  4 讨论及结论
  本研究中从发病鸽、兔中分离出的两株分离菌经鉴定均为屎肠球菌。两者耐药表型存在部分差异,但耐药基因型及毒力基因均一致,均未检出耐万古霉素耐药基因。对氨基糖胺类及大环内酯类的耐药表型与基因型一致,四环素类耐药基因的耐药表型与基因型不一致,提示该地区的肠球菌或许存在其他耐药机制及致病机制等。利用《伯杰氏系统细菌学手册》等标准对分离株鉴型可能不合适,因为表型试验对肠球菌鉴定所用的典型菌株都是人源的,因此分离株与标准中表型可能存在一定的差异[11]。两株屎肠球菌虽来源不同,但序列及生化特性极为相似,且均在腹泻病例中分离,建议临床生产中鸽和兔不要混养,以免引起交叉感染。
  肠球菌属于人和动物肠道中正常存在的菌群,但异位寄生于其他器官会引起感染[12]。肠球菌作为一种益生菌广泛在饲料中添加,伴随抗生素的滥用及环境的影响出现了较多的耐药性菌株及致病株,在临床治疗及饲料添加使用时应提高警惕,尽量减少抗生素的使用,本研究中该分离株是否存在致病性及其他毒力基因(hyl、Sag A等)还需进一步研究。
  赵巧雅, 路晓, 高月花, 刘娜, 胡峰, 刘玉山, 刘小群, 黄兵. 鸡源和兔源屎肠球菌的耐药性及相关基因分析[J]. 家禽科学, 2021, (01): 5-8.

文章来源:家禽科学     文章编辑:一米优讯     
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