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2020年4月，山东省某鸽场及某兔场发生腹泻情况，发病率较高。试验从病鸽及病兔肝脏中各分离到一株革兰氏阳性球菌，通过16S rRNA测序鉴定均为屎肠球菌。两株分离菌均未检测到cylA、gelE、ace等8种毒力基因。药敏试验和耐药基因结果显示，两个菌株都对β-内酰胺类耐药，耐药基因检测结果也一致。这些结果提示屎肠球菌或许能引起鸽及兔感染，对鸽或兔的临床治疗及公共卫生学具有一定的参考意义。
关键词：屎肠球菌;分离鉴定;耐药;毒力基因;
屎肠球菌（Enterococcus faecium）属肠球菌属中的一类，是人及动物的肠道正常菌群之一[1,2]，其代谢产物能够抑制肠系有害菌[3]、调节肠道菌群结构、改善生产性能等[4]，常作为饲料添加剂在养殖生产中普遍应用[5]；同时也是重要的人兽共患条件致病菌，可引起人及动物的感染等[6]，且可通过污染的食物传播给人[7]，在公共卫生学上具有重要意义，因此在生产中应严格筛选菌种。
2020年4月，山东省某鸽场鸽子零星出现精神沉郁、水样腹泻，一周内死亡。同期，某兔场仔兔也发生腹泻情况。本研究以发病鸽和发病仔兔为研究对象，分别无菌采集肝脏进行分菌，通过纯化、16S r DNA测序、生化试验、药物敏感性试验等完成菌种鉴定，利用耐药基因检测分析分离菌的耐药性，为临床治疗及公共卫生提供参考。
1 材料
1.1 病料来源
病料来源于发病鸽场与兔场。
1.2 试剂
2000 DNA Maker购自天根生化科技；p MD-18T克隆载体购自Ta Ka Ra公司；PCR扩增试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒均购自Axygen公司；细菌微量生化管购自北京陆桥技术股份有限公司；药敏纸片购自北京艾博利德商贸有限公司；甘油、1×TE缓冲液、细菌培养基及其他试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
2 方法
2.1 细菌分离纯化
无菌条件下分别取病鸽及病兔肝脏，接种于5%胎牛血清培养基，37℃培养18～24 h，观察记录细菌生长状况及形态。挑取培养或纯化后的单菌落，涂片进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察细菌形态及染色特性。
2.2 生化试验
参照伯杰氏手册，使用杭州滨和微生物试剂有限公司的细菌微量生化管，按使用说明书进行操作及结果判定。
2.3 PCR鉴定
16S r RNA基因片段通用引物，27F:5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3';1492R:5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。取单个细菌菌落悬浮于50μL生理盐水作为模板，按照如下比例配制反应体系：模板1μL，上下游引物（20 pmol/μL）各0.5μL,2×Taq PCR Mix 12.5μL，补充去离子水至25μL。反应条件为：95℃预变性5 min,95℃30 s,55℃1 min,72℃1min，共进行30个循环，最后72℃延伸10 min。将PCR产物克隆至p MD-18T载体，鉴定阳性质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司。
2.4 药敏试验
按照WHO推荐的琼脂纸片扩散法（K-B）对分离菌进行药敏检验，结果按NCCLS标准做出判定。
2.5 耐药基因及毒力基因检测
11种耐药基因[8][(Van A、Van B、qnr A、tet E、flo R、aac(6')-I、tet M、erm B、bla TEM、bla SHV、bla CTX-M）]和8种毒力基因（cyl A、gel E、ace、agg、esp、efa A、acm、fsr）引物序列参照文献[9,10]合成。扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果与Gen Bank序列比对。
3 结果与分析
3.1 细菌分离情况
从病鸽、病兔中各分离出1株细菌，分别命名为G0401、T0402,2株分离菌在有氧和微厌氧的条件下均可生长，37℃培养18～24 h，在血清板上呈现灰白色半透明、圆形微凸、表面光滑、湿润的小菌落，菌落大小在0.5～2.0 mm之间。1000×镜检为单个、成对或短链状的G+球菌。
3.2 生化试验
两株分离菌均能发酵木糖、蔗糖，均能水解精氨酸，不发酵山梨醇、甘露醇，不液化明胶，均符合肠球菌生化特性。
3.3 16S r DNA的测序结果及同源性分析
PCR扩增结果显示，两株分离菌扩增序列大小约为1500 bp的目的条带；鸽源、兔源分离株扩增序列测序后与NCBI公布的登录号为CP044264.1参考序列同源性分别达99.67%、99.74%，两株分离菌鉴定为屎肠球菌，见图1、图2。
注：M:DL2000 DNA Marker;1:G0401 PCR产物；2:T0402 PCR产物；
3：阴性对照。
3.4 药敏试验结果见表1。
两株分离菌对β-内酰胺类、林可霉素类、磺胺类、阿米卡星、多粘菌素、土霉素均为低敏，对新霉素均为中敏；鸽源分离株对恩诺沙星中敏，对氟苯尼考高敏，对强力霉素中敏；兔源分离株对恩诺沙星、氧氟沙星、左氟沙星、加替沙星高敏，对氟苯尼考中敏，对强力霉素低敏。
3.5 耐药基因和毒力基因检测
结果显示，在鸽源分离株及兔源分离株上均发现2个（erm B、bla TEM）抗生素抗性基因；然而8种毒力基因均未检测到。
4 讨论及结论
本研究中从发病鸽、兔中分离出的两株分离菌经鉴定均为屎肠球菌。两者耐药表型存在部分差异，但耐药基因型及毒力基因均一致，均未检出耐万古霉素耐药基因。对氨基糖胺类及大环内酯类的耐药表型与基因型一致，四环素类耐药基因的耐药表型与基因型不一致，提示该地区的肠球菌或许存在其他耐药机制及致病机制等。利用《伯杰氏系统细菌学手册》等标准对分离株鉴型可能不合适，因为表型试验对肠球菌鉴定所用的典型菌株都是人源的，因此分离株与标准中表型可能存在一定的差异[11]。两株屎肠球菌虽来源不同，但序列及生化特性极为相似，且均在腹泻病例中分离，建议临床生产中鸽和兔不要混养，以免引起交叉感染。
肠球菌属于人和动物肠道中正常存在的菌群，但异位寄生于其他器官会引起感染[12]。肠球菌作为一种益生菌广泛在饲料中添加，伴随抗生素的滥用及环境的影响出现了较多的耐药性菌株及致病株，在临床治疗及饲料添加使用时应提高警惕，尽量减少抗生素的使用，本研究中该分离株是否存在致病性及其他毒力基因（hyl、Sag A等）还需进一步研究。
赵巧雅, 路晓, 高月花, 刘娜, 胡峰, 刘玉山, 刘小群, 黄兵. 鸡源和兔源屎肠球菌的耐药性及相关基因分析[J]. 家禽科学, 2021, (01): 5-8.
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