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猪繁殖与呼吸综合征检测与监测技术要点
张宝真 1，刘明杰 2，陈盛楠 2，颜广智 2，涂常松 2，黄良宗 1 *，白挨泉 1 *
（1.佛山科学技术学院，广东 佛山 528000；2.广东方道基因生物科技有限公司，广东 佛山 528225）
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus， PRRSV）引起的一种严重危害全球养猪生产的传染病，其主要危害是引起母猪繁殖障碍和生长猪呼吸道疾病以及发病猪群的继发感染。过去PRRSV被分为两个型，即欧洲型和北美型，然而，最新的病毒分类将该病毒分为两个种，分别为PRRSV-1和PRRSV-2。我国的流行毒株以北美型（PRRSV-2）为主，总体分属于四个谱系：lineage1、lineage3、lineage5、lineage8。当前我国主要的流行毒株是lineage1（类NADC30毒株、类NADC34毒株等）和lineage8（HP-PRRSV等），其中lineage1谱系是当前的优势谱系。目前国内欧洲型毒株（PRRSV-1）在流行率、致病性等方面整体低于PRRSV-2，但PRRSV-1在国内一些地区或猪场呈现流行增加趋势，应引起重视。快速、准确诊断对于猪繁殖与呼吸综合征科学防控具有十分重要的意义。综合运用血清学和病原学检测技术开展诊断检测、明确母猪群和育肥猪群PRRSV是否稳定，了解PRRSV对生产成绩的影响程度是防控和净化PRRSV的基础，厘清生产系统中影响PRRSV活跃的因素能为评估、选择、优化防控措施提供依据。
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PRRS检测技术
1.1 PRRS血清学检测
现有检测PRRSV特异性抗体的方法主要包括：间接荧光抗体检测（Immunological fluorescence assay，IFA）、血清病毒中和试验（Serum virus neutralization，SVN）、免疫过氧化物酶单层试验（Immunoperoxidase monolayer assay，IPMA）和酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。试验感染PRRSV的猪，IFA、ELISA、SVN首次检测到病毒特异性抗体IgG的时间分别为感染后7～11 d、9～13 d和9～28 d，达到高峰的时间则为感染后30～50 d、30～50 d和60～90 d。
感染后5 d内检测到PRRSV特异性IgM抗体，并可维持到感染后21～28 d。试验和田间观察显示IFA、ELISA和SVN检测抗体滴度通常分别在4～5个月，4～10个月和12个月时降至不可检测水平。血清学检测主要用于：1）疾病检测和监测；2）引种检测和引入猪群的PRRS感染情况检测；3）疫苗免疫效果评价。与其他方法相比，ELISA检测操作简便，易于标准化，快速敏感，适合进行大规模流行病调查和疫病监测。
1.1.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）
ELISA是公认的具有高敏感性和特异性、且可批量化检测的方法，在PRRS疫情监测中发挥重要作用。PRRSV ELISA试剂盒常用的包被抗原有全病毒或表达蛋白（N蛋白和GP蛋白）。
1.1.1.1全病毒作为包被抗原的PRRSV抗体间接ELISA试剂盒由于PRRSV感染产生的总抗体可以持续约1年，该试剂盒适用于PRRS阴性猪场检测预警，也可用于阳性猪场了解PRRSV感染动态和评估感染压力。
1.1.1.2 N蛋白作为包被抗原的PRRSV抗体间接ELISA试剂盒N蛋白是PRRSV病毒粒子中含量最丰富的蛋白（占40%）。N蛋白表面存在多个抗原表位，免疫原性较强，而且能同时检测PRRSV-1和PRRS-2的抗体（即不能区分欧洲型和北美型毒株的抗体）。N蛋白抗体产生较早、持续时间短，而且，N蛋白诱导产生的不是中和抗体，该方法不适用于疫苗免疫效果评估，只能用于监测预警。部分试剂盒使用2个酶标二抗（酶标IgM二抗和酶标IgG二抗），更有利于早期感染监测，通过动态监测群体样品S/P值判定感染情况。
1.1.1.3以膜蛋白（M蛋白、GP2、GP3、GP4、GP5）作为包被抗原的PRRSV抗体间接ELISA试剂盒膜蛋白抗体产生较晚，但持续时间长；GP5蛋白能诱导产生中和抗体，因此，采用GP5蛋白作抗原的诊断试剂不仅能用于检测野毒感染状况，还能用于疫苗抗体水平检测，为猪场进行驯化效果评估提供重要参考。
1.1.2 间接免疫荧光抗体（IFA）
IFA是一种检测和定量血清PRRSV抗体的有效方法。该法将活病毒接种于细胞上，有利于保证病毒结构的完整和维持病毒蛋白的天然构象。相比于直接免疫荧光，其敏感度高出约10倍。IFA由于需要复制病毒的缺点，技术和条件要求高，适用于科研，不适合大规模的检测。
1.2 PRRS分子生物学检测
1.2.1 聚合酶链式反应法（RT-PCR）
RT-PCR是PRRSV检测的常用方法之一，该方法具有如下优点：1）对存在于组织样品以及细胞培养物中的病原作出检测诊断；2）RT-PCR在疫病诊断和区分PRRSV的不同毒株中具有优越性；3）RT-PCR产物可以进一步测序分析，了解毒株序列特征。但是，该方法敏感性、特异性等方面不及荧光定量RT-PCR。
RT-PCR主要有三种类型，分别是PRRSV通用型（同时检测欧洲型和北美型）、PRRSV分型鉴别以及PRRSV与其他病毒之间的鉴别。Yang等、施开创等开发的多重RT-PCR可以区分出C-PRRSV、HP-PRRSV和疫苗株。NADC30-like PRRSV是国内主要流行毒株之一，徐雷等、饶云萍建立的RT-PCR能检测出NADC30-like。
1.2.2 实时荧光定量PCR（qPCR）
qPCR主要包括SYBR Green法、Eva Green法和TaqMan法。与SYBR green和Eva Green染料相比，TaqMan法敏感性和特异性更强，已是当前最常用的分子检测方法之一。当前PRRSV TaqMan RT-qPCR方法针对不同基因设计特异性引物和探针，如Nsp2、ORF5和ORF7，许多检测试剂公司已开发用于毒株鉴定的qPCR检测方法。值得注意的是，由于PRRSV变异大，常发生基因重组，其毒株鉴定结果不一定可靠，还需要测序分析验证。
1.2.3 宏基因组二代测序（mNGS）
宏基因组二代测序（metagenomics next-generation sequencing, mNGS）是借助二代测序平台快速测序获得样品中的核酸序列，并进一步与各个物种的基因组序列对比，从而得知样品中微生物的种类和比例的技术。mNGS作为新一代的高通量测序诊断工具，主要用于无偏倚地鉴定病原体。mNGS除了识别已知病原体外，还可以识别新的病原体、变异株以及多种病原混合感染。在新发突发感染、复杂及混合感染等疾病的诊断中具有极高的临床参考价值，具有良好的应用前景。mNGS目前检测费用仍然较高、检测周期也较长，还存在一些需要改进的地方，不能完全取代常规的检测技术，与传统方法联合使用可以提高病原诊断的敏感性和特异性。
1.3 病毒分离
目前，用于分离增殖PRRSV的细胞系有：猪原代肺泡巨噬细胞（PAM）、CL262细胞、Marc-145、HS2H细胞（来源于Marc-145）等。PAM对大多数毒株有较高敏感性，且产毒量高，尤其是PRRSV-1。虽然PAM适用于大多数PRRSV，但其原代细胞生命周期短需要定期制备、原代细胞批次质量不相同。目前最常用的细胞系是Marc-145。当出现新型PRRSV时，其基因的扩增、纯化和鉴定依赖于PRRSV细胞培养分离株；PRRSV病毒分离可为疫苗的开发和致病性等研究提供大量的毒种资源。虽然病毒分离是一种常规、经典的PRRSV检测方法，但其也存在不足：如病毒分离的操作时间跨度大、操作技术要求高、敏感性较低。
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PRRS检测（诊断）与监测
2.1 PRRS诊断需临床诊断与试验诊断相结合
当前，PRRS诊断过程中比较常见的现象是出现两个极端：一是只凭临床情况进行诊断；二是只凭核酸和抗体检测结果进行诊断。确定猪场疫病流行情况，首先要进行临床诊断，但由于PRRSV感染猪只后临床表现各异，临床症状受毒株毒力、宿主免疫状态、共感染等多方面因素影响，临床症状不一，病理变化往往比较复杂，因此仅靠临床诊断不够精准，需与实验室诊断（血清学、核酸检测和病理诊断等）有机结合进行综合判断。
诊断的目的是解决生产实际问题，PRRS诊断不仅需要明确是否发生PRRSV感染，还需要了解感染阶段、对生产影响严重程度，此外，还需要明确混合感染情况，特别是猪圆环病毒、支原体、链球菌和副猪格拉菌等病原和其他诱导因素，才能制定并实施有效的综合防控方案。感染PRRSV后，由于猪场的管理、免疫、预防保健、环境等因素使得猪场的感染情况不尽相同。不同猪场需制定个性化的防控方案，才能更有效地控制PRRS。
生产中，可以通过临床表现及生产数据（母猪繁殖性能、仔猪生长性能及死亡率）判断PRRS是否稳定。稳定时，生产数据一般表现为：返情率≤10%，死胎及木乃伊≤3%～5%，流产比例≤1%，断奶7 d内母猪发情率≥90%，弱仔比例≤10%（1 kg），哺乳仔猪死亡率≤7%，保育猪死亡率≤5%。当不稳定时，母猪常用全年损失的断奶仔猪数量来核算，商品猪常用断奶到出栏猪生产性能损失来核算，将死亡率、料重比、用药成本等折合到出栏1头猪的成本上。PRRS防控经济学分析中应重点关注3个指标：恢复低流行率的时间（Time to PRRSV stability，TTLP）、恢复基线生产的时间（Time to baseline production，TTBP）、总损失（Total loss，TL）（未断奶仔猪数量/1 000头母猪）。
尽管抗体S/P值不能作为检验疫苗效果的标准，但是可以通过长期监测数据来比较抗体变化趋势，以此推测PRRS的稳定性。通过脐带血、睾丸液、家族口腔液、死猪舌尖液、临断奶弱仔猪血样进行采样检测，以评估猪群的垂直传播与水平传播情况。如果免疫PRRSV活苗的猪群核酸检测呈现阳性，需要结合其他分子诊断工具，如ORF5测序、全基因组测序或PCR鉴别诊断方法对阳性样品区分疫苗毒和野毒。
随着PRRSV-1在国内的流行增加，非常有必要加强PRRSV-1的监测。猪场在出现疑似猪蓝耳病的症状时，不仅要检测PRRSV-2毒株，同时需要检测PRRSV-1毒株，避免诊断延后导致治疗不及时带来较大损失。ELISA和RT-PCR或荧光定量RT-PCR已广泛应用于PRRS检测，但是，大部分ELISA试剂盒无法区分PRRSV-1和PRRSV-2。当前有很多实验室和检测机构已建立了PRRSV-1和PRRSV-2鉴别的方法，但国内的检测大多集中在PRRSV-2，对于PRRSV-1的检测较少。
2.2 猪繁殖与呼吸综合征感染状态评估
了解猪群PRRS感染状态是猪场各项PRRS防控措施实施的前提。目前行业采用的PRRS感染的主流分类标准是2019年由AASV（美国猪兽医协会）与美国国家猪肉委员会共同修订的，并在2021年发布在《Journal of Swine Health and Production》杂志。该分类方法对于PRRS防控及生产开展起到很好的指导作用。母猪群分为六类：阳性不稳定群（Ⅰ-A类，高流行率）、阳性不稳定群（Ⅰ-B类，低流行率）、阳性稳定群（Ⅱ类）、阳性稳定群（Ⅱ-vx类，接种后阳性稳定）、暂定阴性群（Ⅲ类）及阴性群（Ⅳ类）。将育肥猪分为四类：阳性群、血清反应阳性群（未散毒）、接种疫苗群、阴性群。PRRS状态分类及净化要求与标准见表1。
更清晰地明确猪群PRRS状态，可以为生物安全等各项PRRS防控措施的实施提供依据，更有效地提升生产成绩，提高生产效益。PRRSV感染状态分类的价值在于其如何使用，特别是在后备母猪进群管理、繁殖猪群和育肥猪群综合运用血清学和病原学检测技术开展诊断检测是PRRS感染分类的客观必须条件。后备猪进基础群前，需了解免疫或驯化是否成功；尽量杜绝PRRSV排毒猪进基础母猪群。明确母猪群和育肥猪群PRRSV是否稳定，了解PRRSV对生产成绩的影响程度是防控和净化PRRSV的基础，厘清生产系统中影响PRRSV活跃的因素，为评估、选择、优化防控措施提供依据。
当前行业中对种猪场PRRS阴性的标准为核酸阴性、N蛋白抗体阴性，膜蛋白抗体也阴性，而且不仅仅是PRRSV-2阴性，PRRSV-1同样需要检测确认为阴性。真正意义上的PRRS净化需要做到病原和抗体均为阴性，而且现在更为严格的标准提出了抗体阴性不仅仅是N蛋白抗体阴性，囊膜糖蛋白抗体也需阴性（囊膜糖蛋白抗体衰减时间明显长于N蛋白抗体）。
2.3 猪繁殖与呼吸综合征测序分析的现实意义
测序技术已广泛应用于病毒学的多个领域，如病毒全基因组测序，新病毒的发现、鉴定和流行病学调查等。病毒基因组测序的应用不仅为检测 PRRSV提供了新的可选工具，同时也为研究人员更好地了解PRRSV的流行病学以及病毒如何传播和进化提供了有力的技术支持。
近几年，对PRRSV进行序列测定及分型越来越普遍。根据PRRSV基因分型追踪猪群是否有新的流行毒株出现是个非常重要的手段，但是，不论是美洲型，还是欧洲型毒株，PRRSV基因重组是非常普遍的现象。由于PRRSV至少有11个开放阅读框，所以，仅根据ORF5或ORF7进行分析并不能反映毒株的全貌。为更好地了解临床致病毒株的基因组序列，建议采用多片段（GP5、GP3、GP2、NSP2、NSP9等）扩增测序分析方式，有条件时可以进行PRRSV全基因组测序分析。
近年来，mNGS作为新一代的高通量测序诊断工具，在多种病原混合感染检测和毒株在新发突发感染及混合感染等复杂病例诊断中具有极高的临床参考价值，在PRRS诊断和追踪猪群是否有新的PRRSV流行毒株、评估驯化效果等方面具有良好的应用前景。
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